[发明专利]一种桉树TPS基因、RNA干扰载体及应用

说明书

本发明通过PCR和RACE技术获得了萜类合成酶(Terpene Synthase,TPS)基因，序列如SEQ ID NO15所示，选取如SEQ ID NO23和SEQ ID NO26所示的序列分别作为正向片段和反向片段构建了降低桉树化感物质含量的RNA干扰载体pART27‑TPS‑RNAi。将该载体转入桉树中，成功获得了低化感物质的植株。本发明为降低桉树化感物质含量基因工程提供了一种重要的化感物质合成酶基因、RNA干扰表达载体以及应用，为RNA干扰及转基因技术在林木分子育种中的应用提供了新的思路。实现了利用RNA干扰原理获得低化感物质桉树新材料的预期目标，为RNA干扰介导的桉树分子育种及基因工程提供了成功的实例，弥补了RNA干扰介导的降低化感物质在本领域研究中的空缺。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别是涉及一种桉树TPS基因、用其构建的用于桉树遗传转化的降低化感作用的RNA干扰载体及在桉树上的应用。

背景技术

桉树(Eucalyptus)具有种类多、生长快、耐瘠薄、干形好、用途广的特点，是我国华南各省区最重要和栽培面积最大的速生阔叶造林树种。然而,桉树的大量引种栽植，也带来了一些颇具争议的生态环境问题，如土壤退化、土地生产力下降、生物多样性减弱等。其中，化感作用是桉树人工材生态系统中颇受关注的生态现象，其表现形式是抑制其他植物及林下植被甚至土壤中的微生物生长，导致林地群落结构简单、生物多样性减弱和生态环境退化等现象，它对桉树人工林群落的结构、功能、效益及发展均具有重大影响。

目前国内外关于桉树化感作用的研究已有不少的报道，取得的主要成果是桉树化感物质成分分析、化感物质的释放途径以及化感作用的生物测定等^]，而有关桉树化感物质的生物合成途径和代谢调控机理等方面的研究尚未报道。研究表明，桉树化感物质的主要成分为a-松油醇(a-Terpineol)和桉叶油素(1,8-Cineole)等萜类化合物。在其他已知的一些生物中，萜类物质的生物合成主要由萜类合成酶(Terpene Synthase，TPS)家族催化完成。首先，牻牛儿基焦磷酸盐(Geranyl-PP，GPP)在TPS的催化下，生成a-松油醇，之后a-松油醇进一步在TPS的催化下生成1,8-桉叶油素；此外，牻牛儿基焦磷酸盐GPP在萜类合成酶TPS的催化下还可以分别生成a-蒎烯(a-Pinene)和β-蒎烯(β-Pinene)。因此，可以推测在桉树化感物质的生物合成途径中，萜类合成酶(TPS)对a-松油醇和1,8-桉叶油素的形成有着重要的调控作用。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNA干扰技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。例如，毕海红在2008年利用RNA干扰技术，通过转基因方式使水稻中AOS基因发生了沉默，由此降低了水稻的化感作用。Kazuaki等(2010)利用紫苏(Perilla frutescens)中的柠檬烯合成酶(limonene synthase,LS)基因对赤桉实生苗的下胚轴进行了转基因研究，结果表明转基因桉树叶片中的柠檬烯含量是野生型的4～5倍。

但是，桉树中a-松油醇和桉叶油素的关键调控基因仍未见记载，更未有利用其构建干扰载体应用到桉树上降低桉树的化感作用的记载，因此有必要在这个方向进行进一步的研究。

发明内容

本发明的目的是从桉树中克隆出一条桉树萜类合成酶(Terpene Synthase,说明书及权利要求书中一般简称为TPS)基因的全长cDNA；并构建相关的RNA干扰载体，此载体包含TPS基因的部分核苷酸序列；再用该干扰载体转化桉树调节其a-松油醇和桉叶油素的合成，以降低桉树的化感作用。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：