[发明专利]一种控制卤虫携带的总细菌数的方法

说明书

技术领域

本发明属于蛭弧菌技术领域，具体涉及一种控制卤虫携带的纵细菌数的方法。

背景技术

卤虫(Artemia)属于甲壳动物亚门鳃足(Branchiopoda)，也称盐水丰年虫。卤虫体长约1～1.3cm，体积大的卤虫其体长可达1.5cm。卤虫也有两性之分，就个头而言，雌性大于雌性，游泳时为仰泳(腹部朝上)，身体的颜色可随水体盐度的变化而变化。卤虫主要生活于盐度较高的高盐水体中，分布于内陆盐湖和海岸盐田。就全世界范围内，目前发现的卤虫栖息地有300多处。最适盐度为30‰～100‰左右，盐度高时虫体呈红褐色。虫体可分为头、胸、腹3个部分。卤虫是水产养殖中一种重要的饵料生物。1977年的研究数据就曾表明，85％的已被养殖的海洋动物都需要投喂卤虫。我国卤虫资源非常丰富。包括沿海盐田的孤雌生殖卤虫和内陆盐湖的两性生殖卤虫，卤虫在未被作为水产动物饵料前，产地附近的居民捞取卤虫成体和幼体作为家禽饵料。但是，卤虫作为某些病原菌和病毒的传播载体，进而为养殖业带来不可估量的危害。因此，控制卤虫自身携带总菌数量，即对卤虫自身健康起着至关重要的影作用，也对防止某些病原菌和病毒的传播载体起着至关重要的影响。对于卤虫自身总菌的控制而言，在水产育苗过程中，养殖户们通常会对引入卤虫饵料使用抗菌素类药物等药物投喂，以达到减少其总菌的效果。但是这些方法有其致命的一面，它不但会导致卤虫自身携带总菌产生抗药性，而且卤虫会将这些带有抗药性的细菌传递到养殖产业，从而对水产生物的育苗产生不利影响。

因此，在使用卤虫作为水产饵料养殖时，我们应当对卤虫自身携带的总菌引起高度重视。目前国内新出现了一种新型的控制卤虫总菌方法。利用蛭弧菌天然的生物裂解活性，将蛭弧菌制剂施用于水体之中，可有效抵抗病原菌对水产生物的侵害，从源头上控制水产生物病害的发生。但是，目前国内将蛭弧菌制剂应用于控制高浓度卤虫自身携带总菌的研究目前尚无报道。因此，利用蛭弧菌制剂控制卤虫自身总菌，从而从源头上对水产养殖中可能存在的致病细菌进行控制，这具有十分重要的意义。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种控制卤虫携带的总细菌数的方法。该方法创新性提出了一种蛭弧菌制剂在控制有益浮游生物卤虫所携带的总菌的方式；并可以适当的延长其制剂中的菌体活性。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种控制卤虫携带的总细菌数的方法，包括以下步骤：

(1)制备蛭弧菌稀释液；

(2)将步骤(1)制备的蛭弧菌稀释液与保护剂进行混合，即得到蛭弧菌制剂；

(3)含卤虫(Artemia saline)的水样的预处理；

(4)将步骤(2)的蛭弧菌制剂与步骤(3)的含卤虫的水样进行混合。

所述的蛭弧菌优选为咸水蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDM01，于2008年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M208066；对所述的蛭弧菌进行负染后透射电镜观察可知：BDM01呈单细胞，弧形，菌体大小为：1.7×1.0μm，端生鞭毛，鞭毛长3.5μm。BDM01采用双层平板培养的方法于28℃培养3天可形成直径3～4mm的透明的圆形噬菌斑；

所述的蛭弧菌稀释液优选通过以下步骤获得：

①宿主菌浓缩液的制备：挑取枯草芽孢杆菌单菌落(枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号为GIMT1.135)，接种于营养肉汤液体培养基中，培养，得到培养液，然后将培养液离心，弃上清，每100mL培养液收集的沉淀用2～3mL DNB(diluted nutrient broth)液体培养基悬浮，得到宿主菌浓缩液，4℃保存备用；

②蛭弧菌稀释液的制备：按照蛭弧菌：宿主浓缩液：DNB液体培养基的体积比1:1:50的比例进行混合，恒温培养，每24h添加一次宿主浓缩液，培养48h，得到培养液；将培养液离心，取上清液过滤，滤液使用质量体积比(g/mL)3％盐度的灭菌蒸馏水调整其浓度，制备得到2×10²～2×10⁵PFU(plaque-forming unit)/mL的蛭弧菌稀释液；

所述的蛭弧菌优选为咸水蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDM01，于2008年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M208066；

步骤①中所述的营养肉汤液体培养基优选为营养肉汤18g/L，pH7.2，121℃高压灭菌15min后保存备用；