[发明专利]一种牛乳β‑酪蛋白多元活性肽的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种牛乳β-酪蛋白多元活性肽的制备方法，其特征在于，利用磷酸盐缓冲溶液分别配制糜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶溶液，然后分别依次用糜蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液和胃蛋白酶溶液对牛乳β-酪蛋白进行酶解，利用超滤离心机分离酶解液获得上清液，将上清液经过纯化浓缩干燥后获得牛乳β-酪蛋白多元活性肽。

2.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：

1)利用磷酸盐缓冲溶液分别配制糜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和牛乳β-酪蛋白溶液；

2)分别依次利用步骤1)配制的糜蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液和胃蛋白酶溶液对牛乳β-酪蛋白溶液进行酶解处理，酶解后获得酶解液；

3)利用离心分离机分离步骤2)所得的酶解液，利用凝胶层析色谱分离获得的上清液，得到多元活性肽溶液；

4)将步骤3)所得的多元活性肽溶液真空浓缩后，冷冻干燥，获得牛乳β-酪蛋白多元活性肽。

3.权利要求1和2所述方法，其特征在于，步骤如下：

1)利用磷酸盐缓冲溶液分别配制糜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和牛乳β-酪蛋白溶液，其中牛乳β-酪蛋白溶液的浓度为1g/L；

2)将步骤1)所得糜蛋白酶溶液和牛乳β-酪蛋白溶液等体积混合调节pH后酶解处理，获得糜蛋白酶水解液；

3)调整步骤2)所得糜蛋白水解液的pH，再与步骤1)所得胰蛋白酶溶液进行等体积混合，酶解处理后获得胰蛋白酶水解液；

4)调整步骤3)所得胰蛋白酶水解液的pH，再与步骤1)所得胃蛋白酶溶液进行等体积混合，酶解处理后获得酶解液；

5)利用离心分离机分离步骤4)所得的酶解液，再利用凝胶层析色谱分离去除获得的上清液中小于700Da的杂质，得到多元活性肽溶液；

6)将步骤5)所得的多元活性肽溶液真空浓缩后，冷冻干燥，获得牛乳β-酪蛋白多元活性肽。

4.权利要求1-3所述方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液为0.1M pH7.2的磷酸盐缓冲溶液。

5.权利要求1-3所述方法，其特征在于，所述糜蛋白酶，添加量为900-1100U，酶解温度为37℃，酶解时间为20-40min，pH6.5。

6.权利要求1-3所述方法，其特征在于，所述胰蛋白酶，添加量为9950-10050U，酶解温度为37℃，酶解时间为1.5-2.5h，pH7.0。

7.权利要求1-3所述方法，其特征在于，所述胃蛋白酶，添加量为10150-10350U，酶解温度为37℃，酶解时间为1.0-2.0h，pH3.0。

8.权利要求1-3所述方法，其特征在于，所述调节pH，使用0.1M的盐酸溶液或碳酸氢钠溶液；所述超滤离心，是在4℃下，利用3kDa超滤离心管，4000r/min，离心20min。

9.权利要求1-3所述方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)利用0.1M pH7.2的磷酸盐缓冲溶液分别配制糜蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液、胃蛋白酶溶液和牛乳β-酪蛋白溶液，其中牛乳β-酪蛋白溶液的浓度为1g/L；

2)将步骤1)所得1000U糜蛋白酶溶液和牛乳β-酪蛋白溶液等体积混合后，利用0.1M的盐酸溶液调节pH至6.5，在37℃下酶解处理0.5h后，获得糜蛋白酶水解液；

3)利用0.1M碳酸氢钠溶液调整步骤2)所得糜蛋白水解液的pH至7.0，再与步骤1)所得胰蛋白酶溶液进行等体积混合，在37℃下酶解处理2.0h后，获得胰蛋白酶水解液；

4)利用0.1M的盐酸溶液将步骤3)所得的胰蛋白酶水解液调整pH至3.0，再与步骤1)所得胃蛋白酶溶液进行等体积混合，在37℃下酶解处理1.5h后，获得酶解液；

5)利用配备3kDa超滤离心管的离心机，在4℃，4000r/min的条件下，离心步骤4)所得酶解液20min，再利用凝胶层析色谱分离去除获得的上清液中的700Da杂质，得到多元活性肽溶液；

6)将步骤5)所得的多元活性肽溶液真空浓缩后，冷冻干燥，获得牛乳β-酪蛋白多元活性肽。

10.权利要求1-9所述方法，其特征在于，用于制备牛乳β-酪蛋白多元活性肽。