[发明专利]一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法

说明书

本申请是发明名称为“一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法”，申请号为201210527869.2，申请日期为2012年12月10日的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种环糊精糖基转移酶及制备方法，特别是一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法。

背景技术

L-抗坏血酸(L-AA，维生素C)是水溶性维生素，参与很多体内的生理活动，在保持和促进人体健康中起到重要的作用，是人体无法自身合成的必需的营养元素。但L-AA极不稳定，在空气中易被氧化为脱氢抗坏血酸，破坏分子中的共轭体系，发生不可逆裂解反应，特别是在空气、光线、热和金属离子的存在下，反应更迅速，使L-AA的生理活性减弱甚至消失，这使得它在应用上受到很大的限制。因此，如何增强L-AA的稳定性是目前国内外学术界和产业界所关注的焦点问题。

2-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)是L-AA的糖基衍生物，是将一个糖基以α-1,4-糖苷键连接于L-AA的C2位上。由于L-AA的C2位上有糖基掩蔽，不易发生氧化反应，所以在水溶液中特别稳定，并且AA-2G没有直接还原性，有效地保护了L-AA的生物活性。所以AA-2G是迄今发现的稳定性和性能最佳的L-AA替代品。

目前，AA-2G主要通过糖基转移酶生物催化生成，其中环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)是最常用的催化酶。通常以α-环糊精或β-环糊精为糖基供体，将葡萄糖基催化转移到受体L-AA上。然而，若以α-环糊精为糖基供体，成本太高；若以β-环糊精为糖基供体，由于它的溶解度较低，酶促反应效率受到较大限制。因此，选择一种既便宜又易溶的糖基供体(如麦芽糊精)将会大大减少AA-2G的生产成本，提高其利润。但是，由于目前环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)对麦芽糊精的底物特异性(转化率)较低，因此，通过分子改造CGTase技术提高其对麦芽糊精的底物特异性，将推动与L-AA糖基衍生物相关行业的快速发展。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶，以Genbank AF047363.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶为出发序列，第195位的酪氨酸突变成丝氨酸Y195S，第260位的酪氨酸突变成精氨酸Y260R，第265位的谷氨酰胺突变成精氨酸赖氨酸Q265K或其组合。

所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)。

所述环糊精葡萄糖基转移酶的获得方法为以Genbank AF047363.1公布的基因为出发基因,将第195位的酪氨酸突变成丝氨酸Y195S，第260位的酪氨酸突变成精氨酸Y260R，第265位的谷氨酰胺突变成精氨酸赖氨酸Q265K或将其组合进行双突变或三突变。

产所述环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌或转基因细胞系也为本发明要求保护的范围。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种产环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：

1)采用化学全合成或PCR方法克隆编码所述环糊精葡萄糖基转移酶基因；

2)将步骤1)获得的环糊精葡萄糖基转移酶基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；

3)将步骤2)获得的重组表达载体转化大肠杆菌BL21得到基因工程菌。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种应用所述基因工程菌发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，以产环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因工程菌为生产菌株，活化后按4％接种量将种子发酵液接到含100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；大肠杆菌在30℃摇床培养至OD₆₀₀＝0.6，加入0.01mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵90h后，将发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体，收集富含环糊精葡萄糖基转移酶的上清液。

软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB05-01(CCTCC NO：M208063)，已在中国专利CN101294149公开，公开日2008年10月29日。