[发明专利]一种基因治疗用载体蛋白及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明提供一种基因治疗用载体蛋白及其制备方法，是可以与治疗性基因表达质粒结合的蛋白，作为基因治疗用载体蛋白。同时还公开了该蛋白的制备方法，并应用此蛋白对多种肿瘤细胞进行效应研究，属于生物工程技术领域。

背景技术

目前用于基因治疗载体主要有两大类，即病毒衍生载体和非病毒载体。

病毒载体转染效率高，但是存在整合入人体基因组的危险及机体免疫反应，广泛应用于临床还需解决这些危险问题。

非病毒载体主要包括化学聚合物衍生载体和蛋白/多肽类衍生载体。目前化学聚合物衍生载体转染效率与病毒载体相当，但是免疫原性强，机体不易降解与清除，靶向性差，限制其应用。

蛋白/多肽类载体可分成天然蛋白类与合成蛋白类。合成蛋白类载体包括多聚精氨酸、多聚组氨酸等，依靠其所带正电荷与DNA结合，携带其进入细胞。这类蛋白/多肽类载体因其具有较强的免疫原性，不适于应用于临床。另外一类源于生物体表达的天然蛋白，他们通过特定空间结构与DNA结合，携带这些DNA进入细胞后，载体蛋白随着蛋白质体内降解途径被机体降解为氨基酸后，为机体所再利用，既无细胞毒性。如果这些蛋白为生物体内高度保守的蛋白，则免疫原性低，不引起免疫反应，也不易在血浆中降解，有利于维持血浆中的浓度。再者，蛋白/多肽类载体易与功能性多肽融合而获得诸如靶向性等优点。蛋白/多肽类载体的低毒性、低免疫原性、易获得靶向性、开发及制备成本低等优点成为基因载体的研究热点。

目前天然的蛋白/多肽类载体多采用组蛋白H1、组蛋白H2A、鱼精蛋白等高度保守的DNA结合蛋白为核心构件，融合促进转染的功能结构域，制备成融合蛋白。但是这些蛋白与合成蛋白类载体相比体积较大，又具有多个非DNA结合结构域，诸如与蛋白分子结合的结构域，使得载体蛋白之间易于相互结合，形成聚合物，是导致转染效率不高的原因之一。再者，蛋白/多肽类载体的跨膜及运输作用机制，尚不十分明确，需要制备多种不同种类的蛋白/多肽类载体，并加以研究，获得大量实验数据，进而阐明载体蛋白转运的作用机制。况且蛋白分子中的非DNA结合结构域的存在，在细胞内表现出与多种蛋白/因子结合，使得机制研究变得更加复杂，将单一DNA结合结构域与多种转染相关功能结构域融合，是研究蛋白/多肽类载体特定结构域功能的有效途径，为蛋白转染机制的研究提供丰富的材料与数据。

本发明采用人源组蛋白H4中一个DNA结合结构域（H4^67-103）作为蛋白/多肽载体的核心结构，该结构在生物体中保守性极高，从植物中获取基因，略加改造就获得与人完全一致的蛋白序列。该结构维持其天然的构象，既可以有效结合DNA，免疫原性又低，是个理想的用于基因载体构建的元件。将H4^67-103与多种已知的促进转染的功能结构域相融合，即可构建出低毒的基因转运蛋白。

发明内容：

本发明提供一种人源H4^67-103多肽，作为DNA结合结构域用于构建基因转运载体。

本发明进一步提供H4^67-103多肽基因的获取方法。

本发明进一步提供载体蛋白，具有与质粒DNA结合，具有将质粒运输到肿瘤细胞的特征。

本发明进一步提供了上述载体蛋全长基因的获取方法。

本发明进一步提供了载体蛋白的原核表达质粒构建、载体蛋白原核表达、纯化及功能验证等详细方法。

本发明提供的人源H4^67-103多肽作为DNA结合结构域用于构建基因转运载体的用途，

其中，所述的人源H4^67-103多肽的氨基酸序列如下：SEQ no.1。

本发明所述的人源H4^67-103多肽的基因的获取方法，包括以下步骤：

1）提取全小麦基因组；

2）以小麦全基因组为模板设计引物，在引物中替换个别核苷酸，使得所扩增的产物所编码的氨基酸序列与人源氨基酸序列一致；并在上游引物上添加酶切位点，用于原核表达载体构建；

所用引物为：

上游引物： 

ATGGCTAGCA TCCGCGACGC CGTCACCTAC ACCGAGCACG CCAAGCGCAA GACCGTC；

下游引物：

ACGTGAATTCTTAGCCGCCGAAGCCGTAG；