[发明专利]一种桉树焦枯病原菌双基因联合PCR检测试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种桉树焦枯病原菌双基因联合PCR检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

桉树与松树、杨树并成为三大世界速生用材林树种，具有较高的经济效益和开发价值。调查显示，世界上的100多个国家均对桉树不同品种有所引进和栽培，但随着桉树种植区域的增加，由Cylindrocladium属病原菌引起的桉树焦枯病发生范围也越来越普遍，其中主要以桉树焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)为主要致病菌。桉树焦枯病作为一种世界性土传病害，严重影响着桉树的正常生长和材积量的生产，对林业经济的发展产生极大威胁。目前，经报道，在中国广西、福建、海南、四川等多个省市和地区具有桉树焦枯病的发生，桉树焦枯病发生面积甚广，已严重威胁着中国现今桉树的林业生产建设。因此，我国在1996年1月5日便将其列入森林植物检疫对象。综上，检测桉树是否携带焦枯病原菌对于桉树焦枯病的防治意义重大，同时也是减少桉树经济损失的重要保障，亟需建立快速灵敏的检测方法，为桉树焦枯病的防治提供依据。

伴随着科学技术的进步，分子生物学的飞速发展，越来越受到人们的接受和认可，如今以利用分子生物学技术为支撑的快速PCR检测技术也被广泛的应用到植物真菌、细菌、放线菌、病毒的检测鉴定中。PCR技术及基于PCR的检测方法因其具有快速、准确、灵敏的特点，使其在植物病害的检测上发挥着越来越重要的作用。双重PCR是标准PCR的发展和完善。双重PCR是指在同一反应体系里加上二对引物，同时扩增出二个核酸片段的PCR反应扩增反应。双重PCR较普通PCR具有更高的特异性和准确度，不仅具有普通PCR操作简单、快速、灵敏度高的特点，而且大大减少了因单一基因PCR扩增而出现假阳性或者检测特异性差的可能性。多基因联合检测是指利用不同的靶基因选择分别进行特异性引物的设计，共同建立检测体系的一种快速检测技术，其各靶基因直接无影响，使得各检测条带清晰明了，对PCR扩增结果的可靠性具有进一步提升。因此，建立桉树焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)的多基因联合快速PCR检测技术对桉树焦枯病的准确、快速鉴定提供了必须保证。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在检测桉树焦枯病原菌中存在的不足，提供了一种桉树焦枯病原菌双基因联合PCR检测试剂盒及其使用方法。

本发明的技术方案如下：

一种桉树焦枯病原菌双基因联合PCR检测试剂盒，其包括：

(1)10×PCR Buffer；

(2)25mmol/L Mg²⁺；

(3)10mmol/LdNTP；

(4)10mmol/LEF-S-4，10mmol/LEF-A-4，10mmol/LBT-S-9，10mmol/LBT-A-9；其中，引物EF-S-4序列为5＇－CAAGAGTCGGATGGAATCAA－3＇，引物EF-A-4序列为5＇－CACAGGAGGTCGTCAAAC－3＇，引物BT-S-9序列为5＇－TGCGTAAGTGCTCATTCTG－3＇，引物BT-A-9序列为5＇－AACTGGAGGTCGGAGGTA－3＇；

(5)5U/μLTag聚合酶；

(6)ddH₂O。

所述的桉树焦枯病原菌双基因联合PCR检测试剂盒的使用方法，其步骤如下：

(1)提取纯培养菌株基因组DNA或所取植物组织样总DNA；

(2)PCR扩增体系50μL：10×PCR Buffer5.0μL，25mmol/LMg²⁺3μL，10mmol/LdNTP1.5μL，10mmol/LEF-S-41.0μL，10mmol/LEF-A-41.0μL，10mmol/LBT-S-91.0μL，10mmol/LBT-A-91.0μL，5U/μLTag聚合酶0.3μL，ddH₂O32.2μL，加提纯的培养菌株基因组DNA或植物组织样总DNA提取液4.0μL，组成反应混合液；

(3)PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，57℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸10min；