[发明专利]永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子在制备组织缺血损伤修复生物制剂中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种含有永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子的生物制剂，用于治疗皮肤全层损伤的治疗制剂，以及组织缺氧损伤修复的生物制剂。

背景技术

永生化人肺微血管内皮细胞是一种来自于人体肺组织微血管内皮的细胞，具有永生化特性、并且可以分泌大量与血管生长相关的细胞因子。该细胞同时转入了含有端粒酶催化组分和类人猿病毒40大T抗原的质粒。这种细胞可以在体外培养超过24个月，具有非常强的生存能力。另外，这种细胞在裸鼠移植试验中不会产生致瘤性。（Generation of Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cell Lines）

人肺微血管内皮细胞来源于血管内皮组织，表达有内皮细胞表面标志物，如血小板内皮细胞粘附分子（PECAM-1，CD31）、血管性血友病因子（vWF）、细胞内粘附分子（ICAM-1）、血管粘附因子（VCAM-1）、E选择素等等。另外，其细胞外基质具有非常强的形成血管能力。正是具有这种特点，这种细胞分泌物可以用于外伤、缺血性疾病等等的临床应用。

体外应用物理的方法对人肺微血管内皮细胞进行干预可以进一步增强该细胞所分泌细胞因子的血管形成能力。通过低氧1%的方法培养细胞24-48小时可以使细胞大量表达Gremlin-1和分泌血管内皮生长因子（VEGF）。Gremlin-1的高表达与缺血缺氧器官组织的血管生成以及抑制凋亡作用有着密切的关系。（Generation of Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cell Lines）

局部缺血性疾病包括心肌缺血、梗塞性脑中风、股骨头缺血性坏死、缺血性肠坏死、难治性皮肤溃疡、糖尿病足等等。

目前尚未有将永生化人肺微血管内皮细胞应用于组织缺血损伤的报道。

发明内容

本发明的目的是弥补现有技术的空白，提供一种永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子在制备修复组织皮肤全层缺损生物制剂和制备治疗缺血缺氧性组织损伤生物制剂中的应用，所述的复合细胞因子为低氧培养永生化人肺微血管内皮细胞所分泌的细胞因子，所述的复合细胞因子不含有遗传物质（DNA或RNA），所述的永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子通过以下步骤制备而得：1）将永生化人肺微血管内皮细胞在体外进行扩增培养；2）永生化人肺微血管内皮细胞用无血清的条件培养基进行培养，并且将培养基进行收集；3）将条件培养基进行离心纯化，截留分子量3.5kDa的物质；4）将离心后培养基（含>3.5kDa分子）进行透析浓缩，得到浓缩液；5）将浓缩液进行冻干处理，得到人脐带间充质干细胞复合细胞因子冻干粉。

优选地，

所述的低氧培养的氧气浓度为1%、5%或10%。

所述的永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子通过以下方法制备而成：

1）永生化人肺微血管内皮细胞的扩增培养：永生化人肺微血管内皮细胞为

贴壁培养细胞，待细胞生长至80-90%融合时进行传代培养；

2）永生化人肺微血管内皮细胞条件培养基的收集：在低氧下培养细胞至第

三代，融合率达到80-90%进行细胞因子的收集，应用无血清内皮细胞培养基进行细胞培养后，将无血清培养基进行收集，检测培养基中是否含有遗传物质，如有则应用电泳方法去除；

3）永生化人肺微血管内皮细胞条件培养基的离心纯化

将所收集的条件培养基进行过滤离心，所用离心滤膜为截留分子量为3.5kDa

的分子滤膜,

4）浓缩

将离心后的条件培养基（含>3.5kDa分子）通过超滤的方式进行进一步的浓缩，通过Slide-A-Lyzer透析膜浓缩2-20倍，得到浓缩液，

5）冻干

将浓缩液放置于容器中进行最终冻干，得到冻干粉。

含有永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子的修复材料，所述的修复材料包括永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子和透明质酸或生理盐水，每10ml修复材料中含有0.1ng-100mg人脐带间充质干细胞复合细胞因子。

所述的修复材料的制备方法包括以下步骤：将复合细胞因子浓缩液或冻干粉按照一定比例加入透明质酸或生理盐水中，配置成每10ml修复材料中含有0.1ng-100mg复合细胞因子的修复材料。

所述的修复材料为胶状修复材料、面膜修复材料或膏状修复材料。

含有永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子的皮肤护理产品。

本发明具有如下技术效果：