[发明专利]一种桉树焦枯病原菌的巢式PCR检测试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种桉树焦枯病原菌的巢式PCR检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

桉树是世界著名的速生造林和用材林树种，因其生长快速、适生性强、经济效益明显、材积材质用途广等特点而被世界各地的100多个国家广泛引种种植。尤其在我国桉树被大量引进和推广，桉树种植区域日渐增加，横跨淮河以南等十几个省区，可见桉树在我国林业经济建设中有着不可取代的地位。但是随着桉树种植密集度的增加，桉树病害也随之普及，尤其是以Cylindrocladium scoparium(桉树焦枯病原菌)真菌引起的桉树焦枯病危害居于首位。桉树焦枯病主要危害1-4年生桉树幼苗，以及成熟桉树的叶片和枝梢，受到病原菌侵染的桉树轻则出叶枯、枝枯或顶枯，大量落叶，使桉树顶部形成扫帚状，严重时整株枯死。感病初期，健康桉树叶片出现针头状大小的水泽斑，病斑逐渐扩大，组织坏死如被烧灼，边缘有一赤褐色晕圈，多数病斑连结造成叶尖和叶缘干枯，病叶卷曲；感病后期病斑中部变灰褐色烫伤状，多数病斑连接成大的枯死斑块，直至全叶卷曲焦枯脱落；枝条染病，表皮层遍布近圆形或长条形的小点，病部微缢缩，有纵裂缝，扩大后若病斑环绕枝干，可造成枝干干枯死亡。此外，该病原菌寄主十分广，主要有尾叶桉、巨桉、巨尾桉、赤桉、蓝桉、大叶桉、柠檬桉、柳窿桉、窿缘桉、纤脉桉、雷林桉1号、雷林桉等几十个重要的桉树品种。除此之外，Cylindrocladium scoparium 真菌还能侵害相思树、丁香年、橡胶树、番石榴、柑橘、南美番荔枝、杜鹃花、腰果树和木薯等重要的园林经济和商品林树种。因此，探求有效、快速的Cylindrocladium scoparium的检测技术对桉树焦枯病的防治具有重要的林业生产实践意义。

目前，世界各国学者对桉树焦枯病的研究主要集中在桉树焦枯病病原菌的分类、生物学特性、生理生化指标、病原菌孢子的形态特征、结构、以及遗传特性方面，对桉树焦枯病原菌分子检测的研究暂无报道。建立桉树焦枯病原菌快速检测体系对于有效检测桉树焦枯病的发生和防治迫在眉睫。

分子生物学诊断技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步的结晶，是在人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的。近年来，分子生物学诊断技术的方法学研究取得了很大进展，先后建立了限制性内切酶酶谱分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分析等方法。随着分子生物学技术的日渐成熟，PCR检测技术也被越来越多的应用到植物真菌、细菌、植原体、病毒、线虫等多种病菌的鉴定和检测中。然而常规的PCR检测往往出现非特异性扩增和假阳性的现象，以致于误导人们对试验结果的判定。巢式PCR是一种变异的聚合酶链式反应(PCR)，使用两对(而非一对)PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次PCR扩增片段的内部)结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，巢式PCR的扩增非常特异，很好的解决了常规PCR扩增中出现的问题。建立快速、灵敏的巢式PCR扩增体系对于检测桉树焦枯病的林业诊断具有重要的理论意义和实践价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在检测桉树焦枯病原菌中存在的不足，提供了一种桉树焦枯病原菌的巢式PCR检测试剂盒及其使用方法。

本发明的技术方案如下：

一种桉树焦枯病原菌的巢式PCR检测试剂盒，其包括：

(1)10×PCR Buffer；

(2)25mmol/L Mg²⁺；

(3)10mmol/L dNTP；

(4)引物：10mmol/L BT-T1-S，10mmol/L BT-CYLTUBIR-A，10mmol/L BT-S-1，10mmol/L BT-A-1；其中引物BT-T1-S的序列为5＇－AACATGCGTGAGATTGTAAGT－3＇，引物BT-CYLTUBIR-A的序列为5＇－AGTTGTCGGGACGGAAGAG－3＇，引物BT-S-1的序列为5＇－GGCTCCAAGAACTATGTGA－3＇，引物BT-A-1的序列为5＇－CCTAACCACGAATGTCAGT－3＇；

(5)5U/μL Tag聚合酶；

(6)ddH₂O。

所述的巢式PCR检测试剂盒的使用方法，其步骤如下：