[发明专利]人类BRAF基因突变检测引物对和探针及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物检测试剂，更具体的说，本发明涉及一种人类BRAF基因突变检测引物对和探针及采用该引物对和探针的检测试剂盒。

背景技术

BRAF基因，全名鼠类肉瘤滤过性毒菌(V-Raf)致癌同源体B1，是RAF基因家族成员，编码丝/苏氨酸蛋白激酶，是癌基因RAS的效应器，也是MAPK级联信号转导组件，涉及多个生理过程，参与调控细胞内细胞生长、分化和凋亡等过程。在多种人类恶性肿瘤中，BRAF基因突变引起的持续激活可使MEK/ERK信号转导紊乱，导致细胞过度增殖，出现恶性转化，如黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺癌均存在不同比例的BRAF突变。约80-90％的BRAF基因突变发生在外显子15的1799位核苷酸上，T突变为A，导致缬氨酸被谷氨酸取代(V600E)。

BRAF基因体细胞突变在乳头状甲状腺癌中比较多见，BRAF V600E突变被认为是PTC最常见的可遗传变异，癌症数据库(COSMIC)在其网站上发表报告显示，78000例存在BRAF基因突变的样本中超过95％为V600E突变。BRAF基因突变作为乳头状甲状腺癌(PTC)发生的驱动性突变，已经成为PTC细针穿刺细胞学标本诊断和病情预后的一个重要指标。BRAF基因突变率在PTC中高达44％，具有很好的诊断意义。BRAF基因突变阳性的甲状腺癌病人较突变阴性病人预后不良。

在黑色素瘤的研究中发现，约50％的晚期黑色素瘤患者中发生了BRAF V600E突变，在一些研究中其突变率甚至高于60％。2011年，首个新型BRAF V600E靶向抑制剂威罗菲尼(Vemurafenib)被FDA批准上市，它能选择阻断RAF/MEK/ERK通道，抑制BRAF突变的黑色素瘤细胞增殖，疗效显著，与放化疗相比能够明显延长无进展生存期和总生存期。

在结直肠癌研究中，BRAF基因突变是结直肠肿瘤预后较差的一个生物标志物，以及区分散发性结直肠癌与Lynch综合征的分子指标。此外，BRAF基因突变的患者对EGFR靶向药物可能存在原发耐药，因此，美国国家癌症综合治疗联盟(NCCN)《结直肠癌临床实践指南》(2013)建议，在使用爱必妥(Cetuximab)或帕尼单抗(Panitumumab)等靶向药物时，对KRAS基因野生型患者进一步检测BRAF基因状态。

目前，对基因突变的检测分析技术方法主要包括：测序、限制性片段长度多态性方法(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、变性高效液相色谱(DHPLC)、基因芯片、液相芯片等方法。这些方法都有各自的优点和缺陷，尚有待改进和标准化。

1.直接测序：Sanger测序法因为可以读到DNA每个碱基的变化，目前被认为是检测基因突变的金标准方法。但是，因为灵敏度低(检测突变灵敏度约为20％)，检测异质性较高的临床肿瘤组织样本时假阴性率高。同时，测序步骤繁琐、耗时长，对设备和操作人员的要求较高，检测周期长，多限于在科研单位进行，大多数医院都无法独立完成检测，不易于形成标准化操作、适合临床单位应用的体外诊断产品。

2.限制性片段长度多态性方法(RFLP)：该方法成本低，对检测设备要求低，突变基因的检出限在5～10％。但是，劳动强度稍大、需专业的技术人员、不适于高通量检测和大规模临床应用。

3.SSCP、DHPLC、基因芯片、液相芯片等方法操作复杂、对设备要求高，仅在科研单位实验室应用，不适合大范围推广使用。

发明内容

有鉴于此，本发明的所解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种检测效果更好、特异性高、漏检率低的人类BRAF基因突变的检测引物对和探针。

本发明的所解决的技术问题还在于提供一种操作简单快捷、特异性高、漏检率低的人类BRAF基因突变的检测试剂盒。

为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供了一种人类BRAF基因突变检测引物对和探针，用于荧光PCR检测，所述引物对和探针的序列如下：

所述引物对包括针对涵盖BRAF基因突变位点的特异性引物对和监控样本DNA质量的内控引物对，所述特异性引物对为：

B-AR-F：GTGATTTTGGTCTAGCTACACA<SEQ ID：1>，

B-AR-R：CTAGTAACTCAGCAGCATCTCA<SEQ ID：2>；

所述内控引物对为：

B-IC-F：ATTGTTACCCAGTGGTGTGA<SEQ ID：4>，