[发明专利]一种嵌合载体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

  

本发明涉及蛋白抗癌药物，更具体地，涉及一种嵌合载体及其制备方法和应用。

背景技术

  

一直以来，控制细胞生长分化中的表达或功能的细胞基因组中如果发生改变都被认为是诱发肿瘤的主要原因。肿瘤的分子生物学研究旨在确定那些在各种肿瘤类型的基因改变，并阐明这些基因在肿瘤发生中的作用。其中，最常见的人类肿瘤突变的基因家族之一就是RAS基因。

正常生理情况下，在细胞受到外界刺激后激活EGFR等信号通路时，野生型的KRAS被活性EGFR等酪氨酸激酶磷酸化后短暂活化，活化后的KRAS可以激活该信号通路中的下游信号蛋白，而后KRAS迅速失活。KRAS激活/失活效应是受控的。然而，突变型KRAS蛋白导致蛋白功能异常，在无EGFR活化信号刺激下仍处于激活状态，其功能状态不可控，导致肿瘤的持续增殖等。RAS基因就像体内的一个“开关”，它在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要调控作用。正常的KRAS基因可抑制肿瘤细胞生长，而一旦发生突变，它就会持续刺激细胞生长，打乱生长规律，从而导致肿瘤的发生。因为KRAS基因突变一般发生在肿瘤恶变的早期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持一致；一般认为，KRAS基因状态不会因治疗而发生变化。因此，检测KRAS基因突变是深入了解癌基因的情况、了解各种癌症的发展预后和放化疗疗效的重要指标，具有极其重要的临床意义。 

在我国，胰腺癌一直以来都是我国人口死亡的十大恶性肿瘤之一，5年生存率不到5%，是预后最差的恶性肿瘤之一。近年来，在广东地区，大肠癌已经成为第二大癌症杀手，有明显增加的趋势，其发病率和死亡率也明显逐年上升。肿瘤细胞RAS基因突变率大约为25%，而胰腺癌，结肠癌和非小肺泡肺癌中分别达到90%，45%和35%。 

发明内容

本发明的目的之一提供一种嵌合载体是通过将能够与GTP-Kras特异性结合的Raf蛋白N端的RAS结合结构域替换Vif蛋白的N端所得。 

本发明另外给出一种嵌合载体的制备方法，包括以下步骤： 

    S1. Raf的蛋白结构上有一个特异性结合GTP-KRAS的RAS结合结构域RBD，将这个RBD结构域替换Vif蛋白N端的1-79 位氨基酸序列，从而构建了一个新的嵌合蛋白RBD-Vif-C；

    S2. 将嵌合载体克隆到表达载体pcDNA3.1上，通过转染进行瞬时表达，

    S3. 从公司合成跨膜肽片段PTD，然后将其连接到pet-32a的大肠杆菌表达载体上

    S4.以RBD-Vif-C为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物RBD-Vif-C连接到pet-32a的表达载体上，并且PTD位于RBD-Vif-C的N端，形成融合表达载体PTD-RBD-Vif-C

    S5. 将PTD-RBD-Vif-C的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，

    S6. 对转化的大肠杆菌进行培养，

    S7. 经镍柱纯化，得到单一的PTD-RBD-Vif-C蛋白，

    其中，S6中，所述培养是将转化的大肠杆菌单菌落接种至含氨苄青霉素LB液体培养基中培养过夜；再按1:50体积比接种到37℃预热的含氨苄青霉素LB液体培养基中培养至OD600达0.6；表达PTD-RBD-Vif-C蛋白加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，经诱导后收集菌体，

    S7中，所述纯化的方法是将总菌体用PBS Buffer洗涤，重悬，超声处理后，高速离心获得裂解上清液，经镍柱亲和层析纯化，收集洗脱的蛋白。

  本发明提供一种上述的嵌合载体在制备抗肿瘤药物中的应用。 

  所述的肿瘤为胰腺癌肿瘤、大肠癌肿瘤或肺癌肿瘤。 

  本发明另外提出一种上述的嵌合载体在制备降解突变KRAS的药物中的应用。