[发明专利]生产华根霉脂肪酶的黑曲霉基因工程菌及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种生产华根霉脂肪酶的黑曲霉基因工程菌及其制备方法，以及所述黑曲霉基因工程菌在生产华根霉脂肪酶中的应用。

背景技术

黑曲霉(Aspergillusniger)是一种重要的工业微生物，在工业酶制剂方面应用广泛，可以产生脂肪酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等30多种酶制剂；此外黑曲霉用于食品酿造和加工方面已经有上百年的历史，因此被美国FDA认定为GRAS(Generallyrecognizedassafe，通常认为是安全的)菌株，可以用于食品和药品级酶制剂的生产。由于黑曲霉具备出色的蛋白质分泌能力、高度的安全性，成熟的发酵及后处理工艺，因此，常被作为宿主菌用以表达异源酶基因。

华根霉脂肪酶（Rhizopuschinensislipase，RCL）是丝状真菌华根霉分泌的脂肪酶，研究表明RCL能够显著增加面包的比容、改善面包结构、延缓面包老化，与国内同类产品相比，RCL在改善面包和馒头的硬度、弹性、胶着性和咀嚼性方面效果更佳，能够替代传统的化学改良剂（如溴酸钾），具有重要应用价值。但是，天然的华根霉产脂肪酶能力有限，而且出于食品安全方面的考虑，它所分泌的脂肪酶不能直接作为食品添加剂。随着分子生物学的发展，RCL的基因被克隆，研究人员在毕赤酵母中实现了RCL的高效表达（中国专利，公开号：CN102911888A），但是毕赤酵母发酵过程中需要添加甲醇，甲醇一种剧毒化学物质，微量的甲醇就会导致中枢神经损害、眼部损害及代谢性酸中毒，因此以甲醇作为诱导剂生产的RCL仍然不能作为食品添加剂。本发明人研究中发现，如果将RCL与其它真菌表达研究中的常用启动子（如构巢曲霉色氨酸合成酶启动子PtrpC、黑曲霉糖化酶启动子PglaA等）融合时，不能有效实现RCL的表达；另外，如果将RCL的成熟肽与其它分泌信号融合时，在黑曲霉中不能有效地实现分泌表达。为了实现RCL在食品加工领域的应用，急需开发一种高产食品级的RCL的菌株。

发明内容

本发明提供一种生产华根霉脂肪酶的黑曲霉基因工程菌及其制备方法，所述黑曲霉基因工程菌能高效地分泌食品级的华根霉脂肪酶，脂肪酶活力最高达到263IU/mL，产生的华根霉脂肪酶分泌到胞外，无需破碎菌体，华根霉脂肪酶存在于培养基中，操作简单，便于分离纯化；并且该黑曲霉基因工程菌培养条件粗放，适合固体培养和液体深层发酵，在产酶条件下不会产生真菌毒素和抗生素，非常适合大规模生产食品级的华根霉脂肪酶。

为解决上述技术问题，本发明的一个方面是涉及一种华根霉脂肪酶表达盒，所述表达盒从5’至3’依次包含以下元件：

（1）扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子Pgpdp；

（2）华根霉脂肪酶基因RCL；

（3）构巢曲霉色氨酸合成酶C基因的终止子TtrpC；

所述Pgpdp的序列为SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，所述RCL的编码序列为SEQIDNO：2所示的核苷酸序列，所述TtrpC的序列为SEQIDNO：3所示的核苷酸序列。

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量筛选，意外地发现，将华根霉RCL编码基因，扩展青霉Pgpdp启动子、构巢曲霉TtrpC终止子等元件组合在一起，可以实现RCL在黑曲霉中的高效表达。同时，本发明人还发现，采用RCL自身的信号肽序列，可以实现RCL的高效分泌表达，分泌水平远高于RCL的成熟肽与其它分泌信号组合的情况。另外，采用扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子Pgpdp可以实现RCL的高效表达，表达量远高于其它启动子，并且生产的RCL分泌到胞外，无需破碎菌体即可分离纯化，操作简单，便于后续产物的回收和精制。黑曲霉为GRAS菌株，它所表达的RCL可以作为食品添加剂，应用于各食品加工领域。

本发明的另一个方面还涉及一种表达载体，所述表达载体含有华根霉脂肪酶表达盒，并且分泌表达华根霉脂肪酶。

本发明的另一个方面还涉及一种黑曲霉基因工程菌，所述黑曲霉基因工程菌含有所述的华根霉脂肪酶表达盒或所述的表达载体，并且表达分泌表达华根霉脂肪酶。

所述的黑曲霉基因工程菌的制备方法包括如下步骤：

（1）获得潮霉素抗性表达盒并克隆至目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；

（2）分别扩增华根霉的脂肪酶基因RCL、扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子Pgpdp和构巢曲霉色氨酸合成酶C的终止子TtrpC，得到有强启动子的RCL基因超表达盒；