[发明专利]一种抗传染性脾肾坏死病毒的DNA疫苗

说明书

技术领域

本发明属于生物工程疫苗领域，涉及一种DNA疫苗，具体涉及一种抗传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）的DNA疫苗。

背景技术

鳜(Siniperca chuatsi)是我国重要的淡水鱼特色养殖品种之一，由传染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV）引起的鳜鱼虹彩病毒病是鳜鱼养殖的主要疫病，导致鳜死亡率接近100％，成为制约鳜养殖业发展的主要瓶颈。长期以来，对于鳜病毒病的防治一直没有有效的药物，而且药物防治疾病弊端众多，如病原耐药性、环境污染、食品安全等。因此作为符合环境友好和可持续发展战略的病害控制措施，疫苗防治正成为国际现代水产养殖业的标准生产规范和研究开发的前沿热点领域。因此，研制与发展鳜传染性脾肾坏死病毒病疫苗是防治鳜鱼虹彩病毒病具有战略意义的辅助措施。

DNA疫苗是通过基因重组技术，由编码某种抗原蛋白质的外源基因和作为真核表达载体的质粒构建的重组质粒。重组质粒通过某种方式被导入生物体内，在宿主细胞中通过宿主细胞的基因转录和表达系统选择性表达外源抗原基因，诱导宿主产生对该抗原蛋白质的特异性免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。主衣壳蛋白（major capsid protein，MCP）是ISKNV的主要结构蛋白，在病毒的感染晚期大量表达，表达量占病毒粒子可溶性蛋白的90%，是主要的免疫原性蛋白。2004年，张敏等进行了ISKNV主衣壳蛋白(Major capsid protein, MCP) 的原核表达，采用免疫印记的方法初步确定了重组MCP蛋白与ISKNV MCP蛋白有相同的抗原特性，为ISKNV重组亚单位疫苗的研制提供了思路。2009年，付小哲等对重组MCP蛋白的免疫原性进行了初步研究，发现重组MCP蛋白有较好的免疫原性，相对免疫保护效果可达到64.3%，可以激发鳜特异性免疫及非特异性免疫应答。到目前为止，还没有以ISKNV MCP基因作为DNA疫苗应用的研究报道。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明研制了含抗传染性脾肾坏死病毒DNA疫苗的重组质粒pcMCP，通过与QCDC佐剂的联合使用，可作为抗鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病新疫苗，其相对免疫保护率达到80%（现有重组MCP蛋白疫苗的相对免疫保护率为64.3%），本发明的MCP DNA疫苗显著优于现有MCP蛋白疫苗。

本发明的目的在于提供一种抗传染性脾肾坏死病毒的DNA疫苗。

本发明所采取的技术方案是：

一种抗传染性脾肾坏死病毒的DNA疫苗，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。

进一步的，上述DNA疫苗的核酸序列在真核表达载体中进行表达。

进一步的，上述DNA疫苗的佐剂为QCDC。

进一步的，上述DNA疫苗在制备预防抗病毒药物中的应用。

进一步的，上述病毒为传染性脾肾坏死病毒。

本发明的有益效果是：

1）本发明构建了一种抗鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病DNA疫苗，是一种新疫苗，其具有很好的免疫原性，相对免疫保护率达80%（现有重组MCP蛋白疫苗的相对免疫保护率为64.3%），显著优于现有MCP蛋白疫苗，可以开发成为抗鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病新疫苗。

2）本发明的DNA疫苗的制备方法简单，容易操作，成本低廉，易于市场推广应用。

附图说明

图1为重组质粒的酶切鉴定图；1为200bp DNA Maker；2为MCP基因条带；3为重组质粒pcMCP经KpnⅠ和 EcoRⅠ酶切后的条带；4为空质粒pcDNA3.1（+）经KpnⅠ和 EcoRⅠ酶切后的条带；

图2为免疫斑点检测pcMCP在鳜脑组织细胞（CPB）中的表达情况，1为转染了pcMCP的CPB细胞；2为空细胞对照；

图3为RT-PCR检测pcMCP在鱼体内的转录表达情况；M为200bp DNA Marker；1为RT-PCR产物; 2为Mcp基因对照；

图4为免疫印迹分析检测pcMCP在鱼体内的蛋白表达情况；1为表达纯化的MCP蛋白；2为注射PBS的鳜鱼肌肉蛋白；3,注射pcMCP的鳜鱼肌肉蛋白；

图5为不同实验组的累积死亡率曲线图，Q+M代表QCDC+pcMCP组；Q+3.1代表QCDC+pcDNA3.1；Q+P代表QCDC+PBS组；P代表PBS组。

具体实施方式

实验例1：

一、DNA疫苗的构建