[发明专利]一种固定化的洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于酶的固定化领域，更具体地，涉及一种固定化的洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶。

背景技术

洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶(BCL)是一种胞外脂肪酶，在水相和非水相均具有催化活性。BCL对多种有机溶剂具有较高抗性，因此广泛应用于非水相催化反应，尤其在制备生物柴油及手性药物的对映拆分领域有着较多应用。但由于酶蛋白本身具有较强的亲水性，游离的酶粉不易分散于溶剂中，能够形成的相对有效的反应界面较小，故存在催化活性低、反应时间长等缺点，在一定程度上限制了BCL在工业上的应用。然而，将固定化酶技术应用于BCL的制备，能够提高BCL在非水相溶剂中的转酯酶活，缩短反应时间。

固定化酶技术在实际生产中应用已经得到了一定的实现，目前已有的BCL固定化方法根据固定化作用力主要分为化学法和物理法。化学方法主要有无载体交联法的使用，Hara P,Hanefeld U,Kanerva L T分别用溶胶包埋法和无载体交联法对BCL进行了固定化，两种不同固定化方法的反应时间仍需要24h以上，化学方法介导制备的固定化酶通常具有较好的稳定性和良好的再利用率，因为制备过程中形成的化学键连接相对物理方法更加牢靠稳固，但对酶蛋白原本的结构也具有较大程度的破坏，导致其蛋白构象变化，从而无法得到较高的酶活。鉴于这一特性，目前对于BCL固定化的报道的大部分都是关于物理方法的研究工作。物理方法主要通过范德华力和氢键等吸附作用，包括物理吸附法、微胶囊法、溶胶包埋等方法，物理吸附法主要优点在于制备条件温和、酶活性中心空间构象不被破坏等。但目前的物理固定BCL的方法催化反应时间较长，转酯得率不高。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种固定化的洋葱伯克霍尔德脂肪酶及其制备方法，其目的在于通过选择适当的基质和方法将洋葱伯克霍尔德脂肪酶固定化，由此解决目前固定化的洋葱伯克霍尔德脂肪酶催化梵音赶时间较长，转酯得率不不高技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种固定化的洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶，其特征在于，包括碳纳米管基质和洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶，所述洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶通过亲和吸附和/或共价结合的方式结合在碳纳米管基质的开放端口、表面和内壁。

优选地，所述固定化的洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶，其碳纳米管基质为经硫酸超声处理的碳纳米管。

按照本发明的另一方面，提供了一种固定化的洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)硫酸超声处理碳纳米管：将每克碳纳米管与100ml至300ml的浓硫酸均匀混合，200W至250W超声处理2小时至5小时，洗涤并过滤后干燥，研磨得到硫酸超声处理的碳纳米管；

(2)制备碳纳米管与洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶混合液：将步骤(1)中获得的硫酸超声处理的碳纳米管加入到洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶溶液中，使得所述碳纳米管与洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的质量比例在1:0.5至1:6之间，形成碳纳米管与洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶混合液；

(3)制备固定化的洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶：将步骤(2)中获得的碳纳米管与洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶混合液在4℃至60℃下，振荡反应1小时至6小时，离心去掉上清液获得所述固定化的洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶。

优选地，所述制备方法，还包括步骤：

(4)制备固定化的洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶干粉：将步骤(3)中获得的固定化的洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶，冷冻干燥，研磨成粉状。

优选地，所述制备方法，其步骤(1)过滤时采用醋酸纤维作为滤膜。

优选地，所述制备方法，其步骤(2)所述洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶溶液，其pH值在5.0至8.0之间。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于借助于碳纳米管六元环结构对生物蛋白分子的亲和作用，利用浓硫酸超声处理碳纳米管，使其封闭端口打开，碳纳米管本身被适当截短，增大其比表面积，使洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶能较好的吸附到碳纳米管上，增加了酶蛋白在反应体系中的分散性，获得了较高的转酯催化酶活，大大缩短了达到反应平衡所需的时间。

附图说明

图1是实施例1酸处理后的碳纳米管扫描电镜表征图；

图2是实施例5固定化洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的催化活力测定结果图；

图3是实施例6时间对固定化效率及固定化酶活的影响实验结果图；

图4是实施例7pH对固定化效率及固定化酶活的影响实验结果图。

具体实施方式