[发明专利]一种筛选抗原不同结合位点的单克隆抗体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种筛选抗原不同结合位点的单克隆抗体的方法。

背景技术

1975年德国科学家Kohler和英国科学家Milstein利用杂交瘤技术将产生抗体的B淋巴细胞同骨髓瘤细胞融合，成功的建立了单克隆抗体制备技术。单克隆抗体技术的基本原理为：小鼠受到外界抗原刺激后可诱发免疫反应，产生相应的抗体，这一职能是由B淋巴细胞来承担的；肿瘤细胞在体外培养的条件下可以无限传代，是永久的细胞。把小鼠的骨髓瘤细胞与经免疫过的小鼠的脾细胞在聚乙二醇等介导下发生融合，融合后的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，一方面可以分泌特定的抗体,另一方面也具备了肿瘤细胞无限增殖的能力, 可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖, 从而分泌大量单克隆抗体。单克隆抗体的理化性状高度均一，生物活性单一，与抗原结合的特异性强，便于人为处理和质量控制，并且可工厂化生产，来源容易。单克隆抗体用途广泛，在生物学、医学和其他研究领域中都显示了极大的应用价值。在医学领域中，单克隆抗体在疾病诊断、判断预后、防治以及致病机制研究等方面起着巨大的促进作用。迄今全球已研制出数万种单克隆抗体。

目前，多数血浆中的各种蛋白浓度的指标多使用夹心ELISA法测定，这种方法特异性好，敏感度高。夹心ELISA需要两个结合同一个蛋白抗原但不同位点的单克隆抗体。制备两个结合同一个蛋白抗原但不同位点的单克隆抗体的杂交瘤细胞株和制备单个单克隆抗体杂交瘤细胞株基本一样, 但在获得阳性克隆细胞株后, 要进行抗体之间抗原结合位点的检测， 只有结合同一个蛋白抗原但不同位点的两个单克隆抗体才可应用于夹心ELISA测定法的建立。制备单克隆抗体包括抗原制备、动物 免疫、建立抗体检测方法、细胞融合、选择杂交瘤、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、稳定性测定以及单克隆抗体的大量生产等一系列复杂步骤， 一般要花费6个月以上的时间。获得阳性克隆后，再检测这些阳性单克隆抗体是否结合同一位点。传统的方法是将所有的阳性单克隆杂交瘤细胞株进行培养生产抗体, 并将这些抗体分离纯化出来，然后将纯化后的阳性单克隆抗体用碱性磷酸酶标记。再利用抑制性ELISA的方法检测这些阳性克隆单克隆抗体是否结合同一个位点。如果两个阳性的单克隆抗体之间不能相互抑制，则说明这两个抗体不结合到同一个位点，这样这两个抗体就可以配对建立夹心ELISA检测方法。

在单克隆抗体的阳性克隆杂交瘤细胞株数量很多的情况下，使用传统方法对党克隆抗体之间抗原结合位点的检测需要大量的工作量和时间。随着越来越多的疾病相关指标的发现和临床应用，对应用于ELISA的配对的单克隆抗体的需求越来越大，特别是ELISA微阵芯片技术的发展，对高质量的配对单克隆抗体的需求更是越来越多。利用ELISA微阵芯片技术，只需要一个血样就可以同时测定成百上千的指标。大大降低了对血样的采集和检测的时间。因此夹心ELISA配对抗体的高通量筛选方法建立迫在眉睫。

发明内容

本发明针对现有技术不足，提供了一种简便、高效、准确的高通量筛选抗原不同结合位点的单克隆抗体的方法。

本发明技术方案如下：

一种筛选抗原不同结合位点的单克隆抗体的筛选方法，包括如下步骤：

（1）将具有2个或2个以上抗原决定簇的抗原免疫小鼠，分离小鼠的脾脏细胞，并将小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，进行选择性培养，利用ELISA方法筛选出阳性克隆抗体杂交瘤细胞株，并分别将各个阳性克隆抗体杂交瘤细胞株进行克隆化培养获得单克隆抗体杂交瘤细胞株，再将每株单克隆抗体杂交瘤细胞株进行培养，分别得到不同阳性单克隆抗体杂交瘤细胞的培养上清液；

（2）将步骤（1）得到的不同阳性单克隆抗体杂交瘤细胞株的培养上清液以两两组合的方式分别加入到共价交联有蛋白A或G的胶乳颗粒的溶液中，孵育后加入抗原， 蛋白A或G可特异性结合抗体, 从而使得单克隆抗体浓缩吸附于胶乳颗粒表面, 如果加入的两个单克隆抗体结合抗原的不同结合位点, 就会使得胶乳颗粒凝集, 从而光吸收度增加。如果加入的两个单克隆抗体结合的抗原结合位点相同, 胶乳颗粒不会发生凝集, 光吸收度不会变化。 通过测定600nM的吸光度变化就可以确认两个单克隆抗体的抗原结合位点是否相同。

  在本发明涉及的技术领域，具有2个或2个以上抗原决定簇的抗原均适应于本发明所述的筛选方法，如cTni, BNP, RBP, LPPLA2, PCT, HbA1c, 纤溶酶原, 纤溶酶抑制剂或ST2。本发明的一个优选的方案中，使用的抗原为人ST2蛋白。