[发明专利]一种稳定抗坏血酸过氧化物酶结构与活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种稳定抗坏血酸过氧化物酶结构与活性的方法，具体地，将酶蛋白加热变性后低温复性保存，属于酶工程领域。

背景技术

抗坏血酸过氧化物酶也称维生素C过氧化物酶，是植物细胞中防御外界氧化胁迫和植物本身活性氧代谢的重要抗氧化酶类，与超氧化物歧化酶和谷胱甘肽还原酶共同参与抗坏血酸一谷胱甘肽循环，调节植物体内活性氧代谢平衡，从而保护由于过量活性氧存在引起的细胞内成分，如维生素C含量的改变。

十字花科芸薹属植物中包括了重要的蔬菜及油料作物，如甘蓝、芥蓝、油菜等，这些蔬菜和作物中维生素C含量的高低直接影响到它们的营养价值。而维生素C含量与胞质中抗坏血酸过氧化物酶活性密切相关。对数据库GenBank中已公布的芸薹属植物胞质过氧化物酶的同源比对发现它们具有高度的同源性。

然而抗坏血酸过氧化物酶极易变性失活，直接影响到对抗坏血酸过氧化物酶酶学性质的研究和应用。添加保护剂和酶修饰技术是目前常用的酶稳定方法(张永帅等.酶修饰研究进展.食品工业科技，2014(2)350-353.)，但是外源物质的添加会影响酶的纯度，酶的结构修饰往往会影响酶的催化活性。所以开发一种简便的、维持原有抗坏血酸过氧化物酶纯度和结构的酶稳定方法，具有研究与应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便的、稳定抗坏血酸过氧化物酶结构和活性的方法。

实现上述目的的技术方案如下：

(1)抗坏血酸过氧化物酶的制备

选取芥蓝胞质过氧化物酶基因(GenBank登录号：KC894750)，克隆到质粒pET-28b(+)中，转化大肠杆菌BL21，37℃培养，至OD₆₀₀达到0.6，向培养基中加入质量体积比终浓度为0.024％异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，诱导表达4h，收获菌体，加入质量体积比浓度为6.25％的Tris-HCl缓冲液(0.02mol/L、pH7.5)，超声破碎15min，10000rpm离心25min得到上清液，经0.22μm膜过滤后，上样于His Trap FF crude层析柱，用结合缓冲液(0.02mol/L、pH7.4的磷酸缓冲液；质量体积比浓度为2.93％NaCl；质量体积比浓度为0.14％咪唑)平衡，再用洗脱液(0.02mol/L、pH7.4的磷酸缓冲液，质量体积比浓度为2.93％NaCl，质量体积比浓度为3.5％咪唑)洗脱，收集抗坏血酸过氧化物酶组分，冷冻干燥，得到纯酶粉。

(2)抗坏血酸过氧化物酶的热变性

将步骤(1)得到的纯酶粉，用磷酸盐缓冲液(0.02mol/L、pH7.5)配制成质量体积比浓度为0.019％-0.19％的酶蛋白溶液，80-90℃下温育20-30min，测定酶的二级结构和酶活性。

(3)抗坏血酸过氧化物酶的低温复性与保存

将步骤(2)热变性后的酶液降温至4℃复性，并在4℃下保存14-42天，测定酶的二级结构和酶活性。

(4)抗坏血酸过氧化物酶二级结构的测定

采用圆二色谱测定未经过热变性处理、热变性处理及处理后复性的抗坏血酸过氧化物酶的二级结构，样品池厚度为0.1cm，扫描波长范围为190～250nm，扫描速度为30nm/min，用Dichroweb软件计算酶中四种二级结构的百分含量。

(5)抗坏血酸过氧化物酶活性的测定

200μL的酶反应体系(0.05mol/L、pH7.0磷酸缓冲液；质量体积比浓度为0.015％乙二胺四乙酸；质量体积比浓度为0.01％的抗坏血酸；适量酶液)，加入质量体积比浓度为0.001％的H₂O₂启动反应，室温下测定290nm处的吸光值，记录反应30s内吸光值的变化。以每分钟氧化1μmol的抗坏血酸的酶量作为一个酶活性单位U。

实施例1

(1)抗坏血酸过氧化物酶的制备