[发明专利]含醛基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种含醛基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法。

背景技术

牛血清白蛋白(BSA)，又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，同时考虑到牛血清白蛋白价格便宜、成本较低、易于检测等优点，本发明使用牛血清白蛋白作为目标蛋白进行偶联实验，探索羟乙基淀粉修饰蛋白质类药物的可行性。

羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)是用糯玉米淀粉(支链淀粉)生产的天然改性聚合物，以玉米或土豆淀粉中的支链淀粉为原料，经过适度的水解、糊化、羟乙基化并经进一步加工精制而成，具有很好的亲水性和分支结构，并且易于实现稳定的大规模生产。羟乙基淀粉作为修饰剂具有如下优点：(1)通过调节分子量、乙基化比例(MS)和C2/C6三大关键属性，可以使得羟乙基淀粉在体内具有不同的代谢效果。(2)HES，如130，具有极高的安全性。(3)与其他同类产品相比具有更低的抗原性。(4)HES的粘度小。

羟乙基淀粉共价修饰蛋白质类药物可以解决或缓解蛋白质或多肽在药用过程中存在的诸多缺点，同时保持合适的天然活性。蛋白质分子中用于与HES进行偶联最常见的基团有氨基，巯基和羧基。由于氨基(多为赖氨酸的e-NH₂)往往位于蛋白质分子表面，加之具有较高的亲核反应活性，是目前蛋白质HES修饰中最常用的被修饰基团。本发明即是选择牛血清白蛋白上的氨基作为HES修饰的目标基团。

发明内容

本发明的目的是提供一种含醛基羟乙基淀粉修饰的牛血清白蛋白偶联物，其采用牛血清白蛋白为实验对象，为药物的羟乙基淀粉修饰奠定了基础；本发明同时提供其制备方法。

本发明所述的含醛基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物，其结构式如下：

其中R₁为氢，R₂为羟乙基，HES’为不包含末端糖单元的羟乙基淀粉，蛋白质’为除去N端氨基的其余部分的蛋白质。

所述的含醛基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物的制备方法是将牛血清白蛋白N端氨基通过还原氨化作用与羟乙基淀粉衍生物的末端醛基相连得到共价偶联物，其中，含末端醛基的羟乙基淀粉衍生物按照以下制备：羟乙基淀粉经氧化反应得到含羧基的羟乙基淀粉衍生物，含羧基的羟乙基淀粉衍生物再与两个含双官能团的化合物反应制得。

所述的两个含双官能团的化合物，其中化合物之一优选为两端具有氨基，最优选1,4-二氨基丁烷；化合物之二优选为一端具有醛基，一端具有羧基，最优选4-甲酰基苯甲酸。

1,4-二氨基丁烷结构式如下：

4-甲酰基苯甲酸结构式如下：

所述的制备方法具体包括以下步骤：

(1)羟乙基淀粉经氧化剂氧化制得含羧基羟乙基淀粉衍生物，含羧基羟乙基淀粉衍生物与1,4-二氨基丁烷的一端氨基通过酰胺键偶联，得含有氨基的羟乙基淀粉衍生物；

(2)含有氨基的羟乙基淀粉衍生物通过氨基与4-甲酰基苯甲酸的羧基通过酰胺键偶联，得含有醛基的羟乙基淀粉衍生物；

(3)含有醛基的羟乙基淀粉衍生物通过末端醛基与蛋白质中的氨基经还原胺化作用偶联。

步骤(1)中，含羧基羟乙基淀粉衍生物与1,4-二氨基丁烷按摩尔比1:150进行反应；氧化剂与羟乙基淀粉摩尔比为1～30:1，氧化反应温度为80～100℃；羟乙基淀粉的分子量为40～200kDa；优选130kDa。氧化剂为碘试液、新制氢氧化铜溶液或菲林试液。

步骤(2)中，含有氨基的羟乙基淀粉衍生物与4-甲酰基苯甲酸按摩尔比1:20进行反应。

步骤(3)中，还原胺化反应采用的还原剂为硼氢化钠、硼氰化钾或氰基硼氢化钠，优选氰基硼氢化钠，还原剂与含有醛基的羟乙基淀粉衍生物的摩尔比为15:1。

本发明的有益效果如下：

本发明采用牛血清白蛋白为实验对象，制备得到含醛基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物，为药物的羟乙基淀粉修饰奠定了基础，本发明的制备方法简单易行，易于实现。

附图说明

图1实施例3制备的偶联物电泳谱图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步描述。