[发明专利]PAMP37-PR39融合抗菌肽及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术制药工业中基因工程生产药物的技术领域，具体为PAMP37-PR39融合抗菌肽及其制备方法。

背景技术

传统抗生素药物的广泛使用，使得许多病原菌对它们产生了耐药性，抗生素添加剂的使用则严重破坏了动物肠道的微生物平衡且易在动物体内残留，严重影响畜产品质量和人类健康。抗菌肽(antibacterial peptides)是生物体产生的一种具有强抗菌作用的多肽，是生物先天免疫的重要组成成分。具有广谱杀菌作用、相对分子量较小、热稳定、水溶性好等优点，更为重要的是抗菌肽对健康的真核细胞几乎没有作用，仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞。抗菌肽的作用机理与抗生素通过阻断大分子生物合成的作用机理完全不同，且病毒和真菌也受抗菌肽的攻击，由此显示了它具有独特的研究和应用价值。

PR39的抗菌作用主要是针对G^-，部分G⁺菌也有抗菌效果。研究表明，PR39的抗菌机制是通过抑制细胞的DNA和蛋白质的合成达到杀菌目的的。PR39对处于对数生长期细菌的杀伤作用迅速明显。扫描电镜实验观察证明，PR39与细胞作用时并没有在膜上形成孔道。对于PR39依靠精氨酸残基的正电荷与细菌细胞磷脂双分子层之间靠静电力作用后吸附在细胞膜上，如何透过脂质双层进人胞内，以及抑制DNA和蛋白质合成的确切机制尚不清楚。另外，PR39对中性粒细胞的趋化作用，引起中性粒细胞在感染部位聚集，促进对病原体的吞噬，可能也是PR39抗菌作用的一个方面。

PMAPs属于猪髓源性抗菌肽，根据其结构差异分为PMAP-23、PMAP-36和PMAP-37，分别含有23、36和37个氨基酸。对其结构预测和色谱分析表明PMAP-36和PMAP-37具有两亲性α螺旋。猪的PAMP37是含有37个氨基酸残基的抗菌多肽，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成α螺旋结构，利用该结构可以在细菌细胞膜上形成穿孔，因此对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有杀伤作用。

然而，现有的研究表明，许多天然的抗菌肽活性并不高，或者对真核细胞存在较高的细胞毒性，因此在作为新型抗生素替代品研制之前需要通过分子改良进一步提高其活性，或降低其毒性。此外，细菌感染已经成为影响畜牧业生产的一个重要原因，尤其是耐药菌株的出现，更是增加了疾病的治疗难度。在当前不少病原菌对原有抗生素逐步产生耐药性时，根据对猪体内自然产生的抗菌肽功能的了解，设计一种新抗菌肽分子来调节猪体内自然抗菌肽的功能以提高抗菌肽活性、替代抗生素，这将对寻找抗生素替代品起到积极的促进作用。

本发明创造性的将猪的抗菌肽PAMP37和PR39进行了融合，融合后的抗菌肽提高了抗菌活性，同时改良了融合抗菌肽的密码子从而得到适于工业大量生产的新型、环保、高活性的融合抗菌肽。本发明提供的猪抗菌肽作为类饲料添加剂，可以很好的提高猪群的抗病能力，能有效替代或减少抗生素作为饲料添加剂的使用，从而提高畜产品安全性。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有高抗菌活性的融合抗菌肽。所述融合抗菌肽包含两种或两种以上猪抗菌肽。

进一步的，所述融合抗菌肽包含猪抗菌肽PAMP37和PR39。

更进一步的，所述融合抗菌肽是将猪抗菌肽PAMP37和PR39串联一起得到的。

更近一步的，所述融合抗菌肽氨基酸序列为序列表中SEQ ID1。

本发明的目的是提供一种融合抗菌肽的重组DNA，所述的重组DNA是经过密码子优化、适合在大肠杆菌表达融合抗菌肽。

进一步的，所述融合抗菌肽的重组DNA序列为序列表中SEQ ID2。

本发明的目的是提供一种能够表达上述融合抗菌肽的载体。优选使用pET30a载体表达上述融合抗菌肽。

本发明的目的是提供一种能够表达上述融合抗菌肽的细胞系。优选使用大肠杆菌BL21表达上述融合抗菌肽。

本发明的目的是提供一种新型抗菌免疫制剂，所述的抗菌免疫制剂中含有上述的融合抗菌肽。

本发明的目的是提供一种高抗菌活性的融合抗菌肽的制备方法。

进一步的，所述融合抗菌肽的制备方法包括：

5)将两种或两种以上猪抗菌肽串联，得到的融合抗菌肽的氨基酸序；

6)根据密码子的偏爱性，设计融合抗菌肽的重组DNA序列；

7)将重组DNA序列构建到表达载体上；

8)将表达载体导入细胞进行融合抗菌肽的表达。