[发明专利]一种分离纯化大鼠肺微血管内皮细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从大鼠肺组织中分离提取高纯度微血管内皮细胞的方法。 

背景技术

微血管内皮细胞位于微血管内表面，是营养物质、致病因子、细胞因子和药物等由血液循环系统进入血管外组织的必经屏障，功能具有多样性，是凝血、充血、瘀血、水肿、炎症、免疫、肿瘤发生等基本病理变化的关键调节点。微血管内皮细胞的体外培养为深入了解其生物学特性提供了重要途径，对研究开发保护和治疗微血管内皮细胞功能障碍所致疾的途径和药物病具有重要意义。 

不同组织器官的微血管内皮细胞表型和功能有显著异质性，某一脏器相关生理病理机制的研究需要培养相应的微血管内皮细胞。尽管当前已有多种动物心、肺、皮肤、脑等组织器官微血管内皮细胞体外培养的报道，但由于微血管的管径小、分散于组织器官内部，不能直接灌注消化液或有效分离出微血管段，微血管内皮细胞的分离纯化技术仍是个难题，难以避免非微血管内皮细胞的污染。 

肺微血管内皮细胞的体外培养当前主要采取酶消化法和组织贴块法，酶消化法易于短期内获得大量微血管内皮细胞，但非微血管内皮细胞会均匀混杂其中，单纯的手工操作难以进行纯化；组织贴块法也因组织样品和处理方法的差异无法确定最佳的去块时间，难以避免肺微血管内皮细胞的游出而污染。 

本发明将酶消化法和免疫磁珠技术相结合，可快速从大鼠肺组织中分离、纯化到高纯度的微血管内皮细胞。 

发明内容

本发明的目的是提供一种分离培养高纯度大鼠肺微血管内皮细胞的方法。 

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。 

一种从大鼠肺组织分离培养高纯度微血管内皮细胞的方法，其步骤如下。 

A. 将大乳鼠断颈处死，剖开胸腔，右心室灌注Hank’s液，无菌取出肺脏，剔除脏胸膜，剪取肺边缘组织，去除大血管，剪碎为小块；所述右心室灌注Hank’s液于4oC预冷，灌注至肺脏发白；所述剪碎为小块的体积约为1 mm³。 

B. 将所述肺组织小块用Hank’s液漂洗，加入消化液中消化；所述的消化液为0.2%胶原酶 和0.1%中性蛋白酶混合溶液，消化温度为37oC，消化时间为20~30 min。将所述消化后的溶液过200目细胞筛，收集滤液离心，沉淀细胞团用0.01 M PBS重悬为单细胞悬液；所述离心处理，转速为800~1200 rpm，时间为5~10 min；所述0.01 M PBS含有0.1% 牛血清白蛋白、2 mM EDTA；所述的单细胞悬液密度为1×10⁷个/mL。 

C. 将所述的单细胞悬液中加入CD31免疫磁珠，孵育得到细胞-抗体-磁珠复合物。所述的CD31免疫磁珠为CD31单克隆抗体与磁珠孵育结合获得，温度为4oC，时间为过夜，密度为4×10⁸个/mL，每毫升单细胞悬液加CD31免疫磁珠25 μL；所述的孵育处理，置于旋转摇床，温度为15~25 oC，时间为30~60 min。 

D. 将所述的细胞-抗体-磁珠复合物从未结合磁珠和细胞中分离；所述的分离处理使用KingFisher 96磁珠分选纯化系统，程序设置为：慢速混合30 s，收集2次，每次5 s；重复4次，细胞-抗体-磁珠复合物释放于含5%胎牛血清、1 mM氯化钙和4 mM氯化镁的DMEM培养基。 

E. 将所述的细胞-抗体-磁珠复合物悬浮液中加入释放缓冲液去除细胞表面结合的磁珠；所述释放缓冲液为DNase 溶液，每毫升细胞悬液加4 μL，温度为室温，作用时间为10~20 min；所述去除磁珠用KingFisher 96磁珠分选纯化系统，程序设置为：中速混合1 min，收集2次、每次1 s，中速释放3 s；重复1次。 

F. 将所述去除磁珠的CD31+细胞离心，用完全培养基重悬，接种孵育培养；所述的离心处理，转速为800~1200 rpm，时间为5~10 min；所述的完全培养基为DMEM培养基，含20%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 IU青霉素和100 μg/mL链霉素；所述的接种培养细胞密度为1×10⁵个/mL。 

G. 所述的接种培养细胞每3天换一次完全培养基，至亚汇合状态时传代培养；所述的传代培养用含0.05%胰蛋白酶和0.005% EDTA的0.01 M PBS溶液消化脱壁，传代密度为1×10⁵个/mL。 

具体实施方式

实施例一。 

1. 主要实验材料。 

（1）实验动物：7日龄SD大乳鼠。