[发明专利]一种高灵敏度的多菌灵完全抗原的合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高灵敏度的多菌灵完全抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

多菌灵是一种广谱、高效、低毒内吸性苯并咪唑类杀菌剂。其化学结构式如下：

其作用机理是，通过干扰细胞纺锤体的形成从而干扰细胞分裂，对植物具有良好的保护和治疗作用。广泛应用于各类农产品中，对多种作物由真菌（如半知菌、多子囊菌）引起的病害有防治效果。可用于叶面喷雾、种子处理和土壤处理等。多菌灵对动物肝、肾和生殖系统具有潜在的破坏作用。

目前检测多菌灵的方法主要是气相色谱法(GC)，液相色谱法(HPLC)，分光光度法、导数同步荧光法、薄层层析-分光光度法、气质联用法等紫外仪器方法，但是这些方法存在操作繁琐，耗时，费用比较贵等缺点，不能实现大量样品的快速检测，因此建立一种快速简便的多菌灵检测方法具有重要意义。

酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。然而得到高亲和力和高特异性的单克隆抗体是免疫学检测的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。

由于多菌灵是小分子物质（分子量 Mw<1000Dal），本身不具有诱导机体产生抗体的能力，需要和蛋白载体偶联后，才能具有免疫原性。但是多菌灵结构中没有可以直接利用的活性基团如-COOH、-NH2 、-OH 或-SH 等，因此，要实现多菌灵和载体蛋白的偶联，首先要进行多菌灵半抗原的设计和合成。

根据相关报道，为了保证半抗原和大分子载体蛋白偶联后能够最大限度的被识别，需要在目标分子和载体之间有一定的连接臂；同时要求连接臂应尽量远离半抗原分子的特征性基团，目的是突出半抗原的特征性结构，突出其抗原决定簇。一般选择4-6个碳链长度的手臂。根据上述原则，本发明设计了多菌灵半抗原及完全抗原的合成方法，为建立多菌灵的酶联免疫分析方法提供了有利条件。

影响免疫分析方法的关键因素在于特异性的抗原和抗体。本发明中合成了由多菌灵的类似物2-氯苯并咪唑和6-氨基己酸反应得到具有羧基的半抗原H1，半抗原H1与载体蛋白偶联制备免疫原；基于异源包被可以进一步提高抗体的灵敏度，另一种半抗原H2由多菌灵的类似物氨基氯苯并咪唑和6-氨基己酸反应得到，H2与OVA偶联得到包被原，这两种半抗原目前尚无文献报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种多菌灵半抗原H1及其完全抗原的制备方法。

本发明的技术方案，

半抗原H1的合成路线如下所示：

一种多菌灵完全抗原的制备方法，步骤如下：

（1）前体261的合成：将氨基己酸甲酯盐酸盐与等摩尔量的2-氯苯并咪唑混合，于二异丙基乙基胺中微波150℃过夜反应13h，得到产物，经纯化，即得到前体261，产率为10%；

（2）多菌灵半抗原H1的合成：将步骤（1）制备的前体261溶于四氢呋喃中，室温搅拌反应过夜，60℃旋蒸除去四氢呋喃，以1mol/L的HCl溶液调节pH 至6~7，制备色谱纯化得多菌灵半抗原H1；

（3）多菌灵完全抗原的制备：将多菌灵半抗原H1与载体蛋白上的氨基进行偶联，即得到多菌灵完全抗原。

步骤（1）所述的氨基己酸甲酯盐酸盐由氨基己酸和氯化亚砜在甲醇中回流制得。

步骤（2）所述多菌灵半抗原H1，其结构简式如下所示：

            H1             。

步骤（3）所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA或人血清白蛋白HAS中的一种。

所述多菌灵完全抗原的制备方法，其具体步骤为：

1）半抗原H1溶液的活化：取多菌灵半抗原H1 35mg，加入2mL DMF溶解，再分别加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC，其中多菌灵半抗原H1︰NHS︰EDC的摩尔比为1︰1.5︰2，室温搅拌反应12h，即得活化的半抗原H1溶液；

2）蛋白溶液的制备：取160mg载体蛋白，再加入10mL 0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液，即得蛋白溶液；

3）反应：将步骤1）制备的活化的半抗原H1溶液慢速滴加到步骤2）制备的蛋白溶液中，室温下反应8h；用PBS缓冲液透析3天，期间换水6次，即得到多菌灵完全抗原。