[发明专利]昆虫Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体涉及昆虫Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA的应用。

背景技术

对于农业虫害，我国长期施用有机氯、有机磷等化学杀虫剂加以控制，这引起一系列问题：害虫出现抗药性,需加大农药剂量,生产成本上升；农药残留导致环境污染严重，危害人类身体健康等。随着社会的发展，迫切需要新型的害虫防治方法。本发明提供一种基于RNA干扰的害虫防治应用。

RNA干扰(RNAi)是一种通常由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默现象，是21世纪以来十大热门科技之一，并于2006年获得诺贝尔奖。这一发现促进了生物学上许多新方法、新技术的出现，并应用于人们的生活当中，例如：人类的疾病治疗、基因功能研究和作物害虫防治等。2008年，Price和Gatehouse总结了众多实验结果后，提出了基于RNAi的害虫防治策略。基于RNA干扰技术的害虫防治具有如下优势：对害虫独有基因进行干扰，抗虫具有专一性，对高等动物和和人类是安全的；对环境无毒无害。

昆虫的几丁质酶基因家族包含多个基因，不同的基因负责不同的生物学功能。Ⅱ型几丁质酶基因即为昆虫几丁质酶基因10(cht10)，它主要负责蜕皮时外骨骼几丁质的降解，昆虫缺失此基因后表现为蜕皮困难而致死。由于高等动物中并没有同类型的基因，故对该基因进行RNA干扰是安全的。该基因在不同昆虫中分化较大，可以设计特异性的dsRNA进行专一的害虫防治，而不影响其他昆虫。

发明内容

本发明的目的提供一种昆虫Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA在致死害虫中的应用。

本发明提供的昆虫Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA的应用，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。该序列是通过对飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因(LmCht10)氨基酸序列分析后，选择飞蝗所特有的几丁质结合域(chitin-binding domain，CBD)，设计上游引物SEQ ID NO：2和下游引物SEQ ID NO：3，通过PCR扩增获得SEQ ID NO：1，其含有T7启动子，核苷酸序列长度为332bp。进一步利用试剂盒合成dsRNA(dsCBD)。

SEQ ID NO：1合成的dsRNA(dsCBD)在致死害虫中的应用：注射上述dsRNA到昆虫体腔，结果表明：SEQ ID NO：1合成的dsRNA可以特异性地沉默飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因的mRNA表达，并导致飞蝗蜕皮困难而死亡。储粮害虫赤拟谷盗注射该dsRNA后，此昆虫的Ⅱ型几丁质酶基因(TcCht10)并没有受到干扰，幼虫也没有出现蜕皮困难的情况，并可以发育至成虫。由此可见，该dsRNA只针对性的干扰飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因，而对其他昆虫同源基因并没有影响。

附图说明

图1：飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因功能域分布示意图。黄色部分为几丁质酶催化域，绿色部分为几丁质结合域。第一个几丁质结合域为飞蝗所特有，为红圈标识。

图2：飞蝗注射SEQ ID NO：1合成的dsRNA，24h后飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因的mRNA表达，β-actin做为内参基因。**P<0.01。

图3：五龄飞蝗注射SEQ ID NO：1合成的dsRNA后出现蜕皮困难而死亡的表型。左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：1合成的dsRNA。

图4：赤拟谷盗幼虫注射SEQ ID NO：1合成的dsRNA，24h后赤拟谷盗Ⅱ型几丁质酶基因的mRNA表达，β-actin做为内参基因。

图5：赤拟谷盗幼虫注射SEQ ID NO：1合成的dsRNA后发育正常。左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：1合成的dsRNA。

具体实施方式

实施例1：飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA的获得

1、飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因氨基酸序列分析

基于飞蝗的转录组数据库，采用生物信息学方法对飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因进行搜索，经过序列分析及比对后，获得飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因(LmCht10)序列，该序列编码2964个氨基酸。在SMART网站上对其进行功能域分析(http://smart.embl-heidelberg.de/)，得到其独有的几丁质结合域1(图1)。

2、飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA合成

1)飞蝗Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA引物的设计