[发明专利]一种铁蛋白重链亚基纳米粒子及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种铁蛋白重链亚基纳米粒子，其特征在于，其在FTH1的N端修饰有穿膜肽。

2.如权利要求1所述的铁蛋白重链亚基纳米粒子，其特征在于，所述穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中的任一种所示。

3.一种杂合蛋白纳米粒子，其特征在于，其由N端修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基纳米粒子和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基纳米粒子组成。

4.如权利要求3所述的杂合蛋白纳米粒子的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)基因工程菌株的构建：分别构建表达N端修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白的基因工程菌株，其中，所用的表达载体为pET-28(+)，所用的宿主菌为大肠杆菌；

(2)融合蛋白的表达和收获：将步骤(1)所述的基因工程菌株接种于LB培养基上培养，加入IPTG诱导表达，然后破碎菌体，离心，分别收获表达N端修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白；

(3)杂合蛋白纳米粒子的自组装：将步骤(2)收获的表达N端修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白在体外进行变性，然后置于透析液中进行梯度透析复性，收获自组装而得的杂合蛋白纳米粒子。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中的任一种所示。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的大肠杆菌为E.colilBL21菌株。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，收获表达N端修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白的方式为将包涵体蛋白进行洗涤和纯化；或者，将可溶性蛋白进行凝胶过滤层析，以达到纯化的目的。

8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的梯度透析复性包括如下步骤：将变性的融合蛋白按比例混合，使得蛋白总浓度为0.1mg/mL；用橡皮筋捆住透析袋的一端，将变性蛋白装入透析袋，用橡皮筋捆住透析袋的另一端；将透析袋置于复性液中，4℃条件下开始复性，复性过程中逐渐减低脲素的浓度，使得变性蛋白慢慢正确折叠，隔6h换一次复性液，经由Step1～Step6复性结束后，将透析袋里的蛋白溶液取出，离心，得上清液，用0.2μm滤膜过滤除去未正确折叠的蛋白沉淀物。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述复性液的配方如下：Step1：50mM Tris，50mM氯化钠溶液，0.5mMEDTA，0.1％PEG，10％甘油，4M脲素，0.2mM GSH，0.1mM GSSG，pH7.9；

Step2：50mM Tris，50mM氯化钠溶液，0.5mMEDTA，0.1％PEG，10％甘油，3M脲素，0.2mMGSH，0.1mM GSSG，pH7.9；

Step3：50mM Tris，50mM氯化钠溶液，0.5mMEDTA，0.1％PEG，10％甘油，2M脲素，0.2mMGSH，0.1mM GSSG，pH7.9；

Step4：50mM Tris，50mM氯化钠溶液，0.5mMEDTA，0.1％PEG，10％甘油，pH7.9；

Step5：50mMFris，50mM氯化钠溶液，10％甘油，pH7.9；

Step6：50mM Tris，50mM氯化钠溶液，10％甘油，pH7.9。

10.如权利要求3所述的杂合蛋白纳米粒子在制备靶向肿瘤细胞的药物中的用途。