[发明专利]一种柠檬酸杆菌溶藻基因的获取方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种柠檬酸杆菌溶藻基因的获取方法。 

背景技术

目前，水污染问题日益加重，尤其是水华的爆发每年都会对人类的生活活动造成不同程度的影响，已严重威胁到人类及其他生物的安全。为了避免传统物理治藻、化学治藻方法在水华治理过程中造成的二次污染，近几年使用生物治藻的研究越来越多，但是这些研究多数集中在表层溶藻现象的研究，很少在基因层面上对溶藻菌的溶藻机制进行研究。 

目前，转座突变技术是一种常用的未知基因获取方法，而常用的用于柠檬酸杆菌突变株构建的转座子如载体pAG408上的Tn5转座子、载体pFAG1820上的Tn5转座子均以卡那霉素抗性基因作为筛选基因，而本发明中的柠檬酸杆菌具有很高的卡那霉素抗性，因此用此类转座子很难进行突变株的构建，寻找合适的适用于该柠檬酸杆菌突变株的构建方法显得尤为重要。 

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种柠檬酸杆菌溶藻基因的获取方法。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：以柠檬酸杆菌突变株基因组为模板进行tail-PCR，扩增出柠檬酸杆菌中转座子插入位点，得到长度为559bp的上游基因，该上游基因序列如SEQ ID NO.5所示，进一步通过PCR扩增技术克隆出其完整下游基因，该下游基因序列如SEQ ID NO.20所示，将上游基因和下游基因拼接，得到完整的柠檬酸杆菌溶藻基因，该基因序列如SEQ ID NO.6所示。 

本发明的有益效果是，通过验证可知含有Tc1/himar1 mariner transposon vector pFAC的质粒pFAC能够成功用于具有高卡纳抗性的柠檬酸杆菌突变株的构建，可以为柠檬酸杆菌基因功能的研究提供技术借鉴，也是首次证明该转座子能够成功应用于柠檬酸杆菌属突变株的构建。同时，柠檬酸杆菌溶藻基因的获得，对于柠檬酸杆菌属细菌溶藻机理的研究具有一定的指导作用。 

所述柠檬酸杆菌突变株(TR1)保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC  No.9199，分类命名：柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)，保藏日期为2014年5月23日。 

附图说明

图1是质粒pFAC图谱。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明的方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明范围，若未特殊指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟悉的常规手段。 

实例1一种柠檬酸杆菌溶藻突变株(TR1)的制备方法，包括以下步骤： 

(1)培养基的配制 

LB培养基的配置：以水为溶剂，每升中含有5g酵母粉、10g蛋白胨和10g NaCl。 

固体培养基的配置：在上述LB培养基中加入2％琼脂粉。必要时，在培养基中加入50μg/mL的庆大霉素(Gm)以增加培养基的选择性。 

MM培养基的配置：以水为溶剂，每升中含有2gK₂HPO₄·3H₂O，0.3g MgSO₄·7H₂O，0.2g(NH₄)₂SO₄、0.03g CaCl₂，0.9gNaCl，微量元素溶液0.5mL，20g葡萄糖；其中，微量元素溶液配方为：MnSO₄1.2311g/L，ZnSO₄0.356g/L，FeSO₄0.256g/L，CuSO₄·5H₂O0.3127g/L。 

(2)柠檬酸杆菌突变株的制备 

(2.1)使用5mL LB(含有50μL浓度为30mM的DAP，7.5μL浓度为10mg/mL的庆大霉素)培养基培养E.coli WM3064，5mLLB培养基培养的柠檬酸杆菌(R1)，培养条件均为37℃，200rpm，12h。 

柠檬酸杆菌R1保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC No.9198，分类命名：柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)，保藏日期为2014年5月23日。