[发明专利]一种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因敲除方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因敲除方法。

背景技术

随着现代社会的发展，能源问题成为日益突出的世界性问题，各国对能源的需求越来越迫切。如何最大效率地获取自然界现存的能源是能源研究和开发领域的关键之一。氮源是重要的资源，农用饲料和肥料中重要成分为氮的铵盐占据很大的比例。78％的空气为氮气，而氮气为惰性气体，N-N健高度不活泼，常规的化学反应难以将氮气转化为有效的铵盐。因此，如能有效地利用空气中的氮资源是获得能源的关键。

固氮微生物是指能够将氮气以化合物的形式固定在与其共生的植物根部并形成根瘤的一类微生物。根瘤菌是最常见的一种生物固氮菌。根瘤菌和紫花苜蓿共生，通过结瘤基因的时序表达，诱导宿主紫花苜蓿形成根瘤，从而将大气中惰性的分子氮转化成可被植物吸收利用的化合物形式的氮。苜蓿中华根瘤菌Rm1021是最为重要的一种根瘤菌，属革兰氏阴性细菌。由于其强大的生物固氮能力，Rm1021的生物学研究较为透彻。

Rm1021的基因组已于2003年测序和解析，但海量的基因组信息远未得到充分利用，仍有许多的基因功能未能阐明。研究基因功能的一个关键方法是构建此基因敲除的变株，通过变株与原株在许多条件下的比较可以得出相应基因的生物学功能。

目前Rm1021基因敲除最为常规的方法是三亲结合转移法。其实验步骤是首先PCR获得并克隆待敲除基因两侧的约1.0kb的同源片段，克隆至含负筛选标记sacB的质粒上后，将含此敲除的重组质粒的大肠杆菌、含tra基因(行使基因的转移的功能)的但不同抗性的大肠杆菌菌株和Rm1021这三个菌株混合，在含重组质粒抗性的平板上，筛选在菌株的重组功能作用下利用一侧同源片段整合至基因组上的整合型菌株。sacB基因编码的蔗糖6-果糖基转移酶催化蔗糖生成对菌株有毒性的聚蔗糖，利用含sacB基因的质粒不能在含蔗糖的培养基上生长的特性，随后将所获得的菌株在含蔗糖的培养基上生长，促使菌株的重组功能催化另外一侧同源片段发生整合而去除质粒骨架部分，最终筛选取抗菌株的基因型而得到基因敲除变株。这种经典的基因敲除方法耗时(涉及多个基因克隆和测序)、繁琐(多菌株和多个操作步骤)且效率较低(最终获得的克隆中可能含有较大比例的原株)。

发明内容

为简便快捷地对Rm1021的基因进行敲除，以高通量地对Rm1021进行功能研究并最终开发出具有更高效率的根瘤固氮微生物基因工程菌株，本发明提供了一种利用重组工程手段对Rm1021进行基因敲除方法。

本发明所涉及的一种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因敲除方法，包括以下步骤：

(1)通过重叠－延伸聚合酶链式反应扩增获得两侧为针对待敲除基因500bp同源片段、中间为卡那霉素抗性基因的融合DNA片段；

(2)融合DNA片段电转化至由异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导的、克隆在质粒pLS2406中的重组酶基因表达的Rm1021细胞中，在卡那霉素抗性筛选之下，卡那霉素抗性基因取代目的基因而获得基因敲除变株；

(3)将基因敲除变株在含0.4％蔗糖的固体培养基中培养以消除含重组酶基因的质粒pL2S406。

本发明所使用的是重组工程方法来介导所转化的线性片段和基因组上同源片段之间的同源重组。重组工程是上世纪90年代末起源的、利用重组酶催化常常是较短的同源片段之间的同源重组而进行基因克隆和基因修饰的一种生物技术手段。短同源片段可通过碱基合成，因此可通过PCR引物的形式加以合成，这就避免了繁琐的基因克隆操作步骤。最常用的重组酶基因是来源自λ噬菌体的、位于一个操纵元上的exo、bet和gam三个基因。各基因的功能为：exo基因编码DNA5'至3'外切酶，其外切双链DNA分子而得到DNA单链；bet基因编码单链结合蛋白，其结合在DNA单链上并行使同源片段之间的同源重组功能；gam基因编码抑制内源性核酸酶的Gam蛋白，可避免细胞本身对外源基因的降解。