[发明专利]一种小麦茎基腐病菌的分离方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种病菌的分离方法，具体的说是一种小麦茎基腐病菌的分离方法。

背景技术

在进行病原真菌的形态、生理、生态及致病性的分子生物学等理论性研究工作中，以及进行品种抗病性鉴定和筛选对病原菌有抑制作用的药剂等应用性研究工作中，常常需要病原真菌的纯培养物。植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，一般都能恢复生长和繁殖。然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其它基物中将病原菌单独分离出来，称作植物病原真菌的分离。植物病原真菌的分离在植物病理学科研工作中也具有十分重要的位置：对分离到的病原真菌进行保存可以满足植物病理学及微生物学日常的教学需要，使学生对植物病原真菌有更直观的认识。

近年来，随着气候变暖及秸秆还田等耕作栽培措施的推广，小麦茎基腐病在我国各大麦区发生普遍并造成一定的损失，为害日益严重，逐渐引起农业科技工作者的重视。小麦茎基腐病从小麦分蘖到成熟期均可发生，可使茎基部叶鞘和茎秆变褐，茎节坏死，严重时可使植株死亡、枯白，出现白穗，影响小麦产量。小麦茎基腐病由多种病原真菌侵染引起，主要的致病性真菌类群包括镰孢菌（Fusarium spp.）、小麦根腐离蠕孢（Bipolaris sorokinianum）及其它一些真菌，其中前两者的分离比率很高，但不同小麦生态区域的致病菌种类存在一定差异。鉴于小麦茎基腐病在我国小麦生产区呈流行蔓延的趋势，有必要加紧对其防治策略的研究。由于引起小麦茎基腐病的病原菌均属于兼性寄生真菌，可从发病小麦植株的茎基部分离获得纯培养，为以后的病原菌种类确认、抗病性品种鉴定及药剂筛选等工作提供便利。小麦茎基腐病菌的分离是进行后续研究的基础。

植物病原真菌的分离包括组织分离法和稀释分离法。由于组织分离法存在着费时、费力、成本高、操作要求高等特点，故不适宜对大量的小麦茎基腐病病株进行病原菌分离。

发明内容

本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种小麦茎基腐病菌的分离方法，省时、安全，可大用于大量的小麦茎基腐病病株进行病原菌分离；分离成功率高，处理后的茎秆可很快长出菌丝，转入PSA上后也能很快长出小麦茎基腐病菌的典型菌落，成功率达95%以上。

一种小麦茎基腐病菌的分离方法，其操作步骤为：

步骤一、采集有白穗症状且茎秆基部第一、二茎节处的叶鞘或茎秆变褐色的小麦植株，备用；

步骤二、将采集到的小麦植株在室内通风阴凉条件下摊开放置1-2天；然后从放置后的小麦植株基部第一、二茎节处变褐色部分剪取1.8-2.2㎝茎段；将所剪取的茎段用清水冲洗干净，然后用75%酒精消毒15s，再用无菌水漂洗2-3次，备用；

步骤三、将剪取的茎段放入皿底铺有无菌滤纸的培养皿里，向培养皿中加入1-2mL无菌水，然后置于生化培养箱中，25℃、黑暗条件下培养1-2天，以便于植株表面的水分挥发；直至茎段上长出菌丝，备用；

步骤四、用接种针从每个茎段上挑取菌丝，分别接种到添加乳酸的PSA培养基上，然后置于25℃生化培养箱中黑暗培养2-3天；

所述乳酸的添加量为每200mLPSA培养基中加入1mL质量百分比为 25%的乳酸；

步骤五、用接种针从菌落边缘挑取小块菌落，转至PSA斜面培养基上，置于生化培养箱中，25℃、黑暗条件下培养3天后，进行菌株保存，即分离出小麦茎基腐病菌。

所述PSA培养基，每100mlPSA培养基中含马铃薯20g，蔗糖2g，琼脂2g，pH值为6.0，余量为水。 有益效果是：

1、本发明小麦茎基腐病菌的分离方法，将从田间采回的小麦植株室内通风阴凉条件下放置1-2天，待上面的水分挥发后再进行后续处理，能让茎秆上尽快长出菌丝；；为了排除细菌污染，茎段保湿前应先用75%的酒精消毒，时间太短达不到消毒效果，太长则对要分离的小麦茎基腐病菌造成伤害，以15 s为宜；另外，每200 mL PSA中应预先加入25%的乳酸1 mL，酒精结合乳酸的效果，既达到抑制细菌滋生的作用，又有利于小麦茎基腐病菌的分离。本发明方法分离成功率高，处理后的茎秆可很快长出菌丝，转入PSA上后也能很快长出小麦茎基腐病菌的典型菌落，成功率达95%以上。