[发明专利]一种“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编辑猪的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编辑猪的制备方法。

背景技术

肌肉生成抑制素(Myostatin,MSTN)作为一种肌肉生长的负性调控因子，其突变可引起肌细胞的增生和肥大，从而造成肌肉质量的增加。另外，由于它是一个肌肉发育特定因子，对它进行的基因工程操作不会影响其他组织，因此，在农业、渔业、畜牧业和医药等很多方面都有广泛的应用前景和商业价值。

我国是世界猪肉消费第一大国，许多育种学家致力于高瘦肉率的猪种的培育工作。对自然筛选培育出的比利时蓝牛的测序发现，其MSTN基因外显子3中，保守的生物活性区11bp的缺失造成了双肌现象。该发现为家畜的育种工作提供了新的思路，即：通过基因组编辑技术结合体细胞核移植等方法，制备出“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编辑家畜。

近年来兴起的锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases,ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases,TALEN)和成簇规律间隔短回文重复与Cas9蛋白(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)等基因组编辑技术，可以在靶位点切割DNA双链，诱发细胞内源性修复机制，通过同源重组修复或非同源末端连接途径，从而提高了基因的敲除、定点整合和替换效率。相较于传统的基因打靶技术，其基因编辑效率大大提高，且由于不带筛选标记，具有更高的安全性。近年来，这些新型的技术已经在猪，牛，羊等多种家畜中实现其基因组的定点修饰，肉品质、生长速度、抗病能力等关键生产性状的基因改良也取得了一定的突破。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备“仿比利时蓝牛”MSTN基因型转基因细胞的方法。

本发明提供的方法，为对目的动物离体成纤维胎儿细胞基因组的MSTN基因外显子3中的靶点区域进行基因组编辑，使外显子3提前形成终止密码子而终止表达，得到“仿比利时蓝牛”MSTN基因型转基因细胞；

所述靶点区域为序列1自5’末端第847-899位的核苷酸。

上述方法中，所述基因组编辑通过CRISPR、TALEN或ZFN进行。

上述方法中，所述基因组编辑通过TALEN进行，采用TALEN进行基因组编辑对应的切割区域为序列1自5’末端第863-882位核苷酸。

上述基因组编辑的方法包括如下步骤：

(1)将重组质粒pcs2-TALE-peas-1L和重组质粒pcs2-TALE-peas-1R共转染目的动物离体成纤维胎儿细胞中，得到单克隆细胞；

所述重组质粒pcs2-TALE-peas-1L为表达特异识别序列1自5’末端第847-862位核苷酸的蛋白的质粒，其为将序列2所示的DNA分子通过NheI和Spe I酶切位点连入pCS2-FokI载体得到的重组载体；

所述重组质粒pcs2-TALE-peas-1R为表达特异识别序列1自5’末端第883-899位核苷酸的蛋白的质粒，其为将序列3所示的DNA分子通过NheI和Spe I酶切位点连入pCS2-FokI载体得到的重组载体。

(2)用于扩增MSTN基因切割区域的引物对对所述单克隆细胞进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，选取扩增产物中含有突变型MSTN基因对应的单克隆细胞为含有“仿比利时蓝牛”MSTN基因型细胞；即为“仿比利时蓝牛”MSTN基因型转基因细胞。

所述“仿比利时蓝牛”MSTN基因型为野生型MSTN基因第3外显子提前形成终止密码子得到的基因型；

所述突变型MSTN基因为野生型MSTN基因的切割区域中插入1+3n或者缺失2+3n个碱基数得到的基因；n为大于等于1的整数；

所述野生型MSTN基因的切割区域为序列1自5’末端第863-882位核苷酸。

所述野生型MSTN基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

上述方法中，所述用于扩增MSTN基因切割区域的引物对由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成。

上述方法中，所述动物为哺乳动物，具体为猪，所述猪的品种尤其具体为陆川猪、五指山猪、大白猪或梅山猪。

本发明的另一个目的是提供一种制备“仿比利时蓝牛”MSTN基因型的基因编辑动物的方法。