[发明专利]一种核酸测序用微流控芯片

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种核酸测序用微流控芯片。它能够广泛用于核酸测序、基因突变检测以及分子诊断等领域。

背景技术

从20世纪70年代中期Sanger法核酸测序技术出现以来，核酸测序技术已经取得了巨大的进展，特别是随着人类基因组计划的完成，核酸测序技术大大改变了生命科学诸多领域的研究面貌。

作为第一代测序技术，Sanger测序法方便简单，可靠性高，测序片段长，也成为人类基因组测序所采用的测序技术，但是Sanger测序法无法进一步的微量化，测序通量也受到限制。随着相关生物技术的发展与深入研究，DNA测序技术也得到了不断的创新与改良，在保证测序精度的前提下，操作程序已经逐步优化，速度逐渐提高，成本也呈下降趋势。新一代的测序技术也就应运而生，这类技术都是将片段化的基因组DNA连接上通用接头，随后应用不同的方法方式来产生上百万甚至更多的单分子多拷贝PCR克隆阵列。之后进行引物杂交与酶的延伸反应，这些反应可以大规模的同时进行，可以实现一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定,然后对每一步反应所产生的信号进行同时的检测，以此来获取测序的数据，经过计算机分析获得完整的DNA序列信息。Roche公司本世纪初最先推出了高通量测序平台，开启了高通量测序的新时代。随后是基于合成测序的Solexa技术，以及基于杂交连接测序的SOLiD技术。

454测序技术是将单链DNA文库固定于专门设计的DNA捕获磁珠上，不同的磁珠上固定有不同的单链DNA模版，随后经过乳液PCR扩增，形成单分子多拷贝的分子簇。将磁珠从乳液体系里面释放出来以后放入由PTP板构成的芯片上，PTP板上有只能容纳单个磁珠的微井，在微井中进行后续的测序反应。利用焦磷酸测序基本原理，对每个微井中的DNA片段分子进行准确快速的碱基序列的测定。该技术平台最主要的优点就测序读长较长，目前可以准确进行1000个以上的碱基序列分析。但是缺点在于反应液和洗涤液进入PTP的微井阵列为“漫过式”反应，因此限制了测序速度。

SOLiD测序主要以四色标记的寡核苷酸的连续的合成为基础，这样可以对单拷贝DNA模版进行大规模的扩增和高通量的并行测序。SOLiD测序样品制备方案与其他技术类似，首先进行物理破碎DNA，然后连接通用接头，然后在乳液体系里进行大量的扩增，使大量的单分子多拷贝的DNA分子簇集中于微小的磁珠上，将经过扩增的富含测序文库的磁性微球固定于玻片的表面进行测序生化反应。该反应同样为“漫过式”反应，速度较慢，而且磁珠背景荧光较高，对测序仪器灵敏度要求高。

Solexa测序首先将基因组DNA进行片段化处理，回收段片段DNA(200-500bp)进行通用接头的链接。再将其处理成为单链状态，然后通过与芯片微通道表面的单链引物碱基互补而被固定于芯片微通道的底面上，另一端随机的与附近的另一个引物进行互补，形成“桥”，利用这种方式，进行30个左右循环的扩增后，每个分子会放大上千倍，成为单克隆DNA簇。在后续的测序反应中四种荧光标记的染料边合成边测序，每个循环中，荧光标记的dNTP是可逆终止子，只允许掺入单个碱基，主要就是因为3’羟基末端有可被识别的切割位置。不同碱基用不同荧光标记就可以激发出不同波段的荧光，这样统计每轮反应下来收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。但是该芯片同样为“漫过式”反应，需要试剂浓度较高，而且对于芯片的修饰均匀性要求非常高，测序成本相应增加。

Life公司近年来针对临床应用推出了SOLiD的继承者IonTorrent技术，该技术在类似PTP板的微井阵列中检测测序反应中释放的氢离子带来的PH的变化，简便快速，读长长，非常适合用于临床检测，但是该芯片价格较高。除此之外还有很多针对单分子的测序技术的发展，比如Pacific技术和纳米孔测序技术等等，虽然这些技术还存在这样那样的问题，但已经在不断研究应用中逐步改善，有望在将来的测序中大规模的应用。

尽管测序技术的发展日新月异，但是目前所有的测序平台都是基于芯片的生物分子检测，芯片的设计与制备对于测序的效率和速度至关重要，目前主流的芯片主要是微流通道和微孔结构，而且需要复杂的基底修饰和昂贵的原材料。研究新的能够高效快速的进行生化反应、选择成本低，稳定性好的材料制备用于DNA测序的微流芯片对于新一代高通量测序技术的发展提升和成本的进一步控制意义重大。

发明内容