[发明专利]一种杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法

权利要求书

1.杜仲药材或原植物快速分子鉴别的特异性DNA片段，其序列如序列表中序列1所示。

2.杜仲药材或原植物快速分子鉴别的一组引物，该组引物由序列表中序列1所示序列设计合成，其序列如序列表中序列2和序列3所示。

3.权利要求2所述的引物在杜仲药材或原植物的快速分子鉴别中的应用。

4.包括权利要求2所述引物的试剂盒。

5.杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：利用序列为序列2和序列3所示的引物对鉴别样品进行PCR反应；再采用以下两种方法之一进行鉴别：将PCR反应产物加入含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，电泳后在紫外凝胶成像系统下观察，在400bp处出现条带的样品即为杜仲药材或原植物；或者在PCR反应产物中加入SYBR Green I核酸荧光染料，混匀后在紫外光下观察，PCR反应产物产生绿色荧光的样品即为杜仲药材或原植物。

6.根据权利要求5所述的杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，所述的对鉴别样品进行PCR反应包括：提取鉴别样品的基因组DNA，用该基因组DNA作为模板，利用序列为序列2和序列3所示的引物进行PCR反应。

7.根据权利要求6所述的杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，所述的提取鉴别样品的基因组DNA具体包括以下步骤：取鉴别样品2～5mg，用植物DNA提取试剂盒、CTAB提取法或碱裂解法提取基因组DNA。

8.根据权利要求5～7任一所述的杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，所述的PCR反应体系为25μL，反应液组成为：Taq酶预混液5～11μL，上游和下游引物各为5～40pmol，DNA模板50～200ng，灭菌重蒸水加至25μL；反应程序为：94～96℃预变性30～300s，94～96℃变性2～30s，45～65℃退火2～30s，71～73℃延伸2～45s，变性、退火、延伸一共进行27～39次循环；最后71～73℃后延伸18～300s；PCR反应产物的检测，采用以下两种方法之一进行：取4～7μL PCR反应产物加入含溴化乙锭的1.0％～1.5％琼脂糖凝胶中，65～100V稳压电泳35～50min后，在紫外凝胶成像系统下观察；或者在PCR反应产物中加入1～3μL100×SYBR Green I核酸荧光染料，混匀后在300～400nm紫外光下观察。

9.根据权利要求8所述的杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，所述的PCR反应体系为25μL，反应液组成为：Taq酶预混液6.5～9μL，上游和下游引物各为10～20pmol，DNA模板50～150ng，灭菌重蒸水加至25μL；反应程序为：94～95℃预变性30～120s，94～95℃变性2～10s，60～65℃退火2～15s，72～73℃延伸2～15s，变性、退火、延伸一共进行29～33次循环；最后72～73℃后延伸20～60s；PCR反应产物的检测，采用以下两种方法之一进行：取5～6μL PCR反应产物加入含溴化乙锭的1.1％～1.3％琼脂糖凝胶中，70～85V稳压电泳35～45min后，在紫外凝胶成像系统下观察；或者在PCR反应产物中加入2～3μL100×SYBR Green I核酸荧光染料，混匀后在340～380nm紫外光下观察。

10.根据权利要求9所述的杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，所述的PCR反应体系为25μL，反应液组成为：Taq酶预混液7.5μL，上游和下游引物各为10pmol，DNA模板80～120ng，灭菌重蒸水加至25μL；反应程序为：95℃预变性45s，95℃变性5s，62℃退火5s，72℃延伸5s，变性、退火、延伸一共进行30次循环；最后72℃后延伸30s；PCR反应产物的检测，采用以下两种方法之一进行：取5μL PCR反应产物加入含溴化乙锭的1.2％琼脂糖凝胶中，80V稳压电泳40min后，在紫外凝胶成像系统下观察；或者在PCR反应产物中加入2μL100×SYBR Green I核酸荧光染料，混匀后在365nm紫外光下观察。