[发明专利]人乳头状瘤病毒的快速基因型鉴定分析及其装置

说明书

本申请要求2010年4月29日提交的美国专利申请序号12/770034的优先权，该申请是部份接续2006年4月4日提交的美国专利申请序号11/398433，而后者是部分接续2002年11月7日提交的美国专利申请序号10/291168，同时该申请声明要求2001年11月7日提交的美国专利申请序号60/345948的权益。美国专利申请序号11/398433也是部分延续2002年11月9号提交的美国专利申请序号10/293248。前述申请内容特此全文并入本申请中作为参考。

技术领域

本发明是关于鉴定人乳头状瘤病毒的多种基因型。

背景技术

鉴定人类白细胞抗原(HLA)

在器官或骨髓移植中，通过准确的HLA分型使得供体和受体相匹配(4)，是预防急性移植物抗宿主病(GVHD)发生的关键。HLA分型通常是通过标准血清学分型(2)来完成。最近的研究表明，DNA分型提供的结果更加准确和肯定(7，9，8)。将HLA-DQ、HLA-DR和HLA-DP分型检测结果用于高精度匹配，这已是选择潜在器官捐献者的必备途径(3)。先前已有报道，利用序列特异性引物的聚合酶链反应(SSP-PCR)扩增，可进行HLA基因分型。然而，由于HLA-DQ、DR和DP位点的高度多态性，所需序列特异性引物(SSP)的数目将会多达数百个，超出了多重PCR扩增极限，从而无法进行有效的PCR扩增。要确保HLA基因分型的结果在临床上有实际应用，必须设置多项检测，每项各有50至100个独立的PCR反应。如今市场上提供一种试剂盒，其中包括一个扩增过程，需要进行96个独立的PCR反应，然后对凝胶电泳分离得到的片段大小进行分析。这不仅耗费时间和金钱，而且非常容易出现差错，因为反应设置复杂，另外判断凝胶电泳中片段大小也存在不确定性。因此，DNA测序仍然被认为是HLA基因准确分型的首选方法。遗憾的是，由于在序列上高度同源，假基因也可以在聚合酶链反应(PCR)中被共同扩增，使得单独通过DNA测序进行高分辨HLA基因分型将会更加困难并且昂贵。授予JWO Tam先生的美国专利第5471547和6020187号，公开了一种可以在费用低廉的设备上进行的快速退火过程，用于准确的突变型检测、基因分型和指纹图谱分析。本发明公开了一种使用改进的导流方式，利用ASO寡核苷酸探针对HLA基因座DP、DR和DQ beta序列进行快速分析的方法。

DNA指纹图谱快速鉴定人类和生物体

1985年，基于限制性片段长度多态性(RFLP)的DNA指纹图谱首次应用于人类身份鉴定(12)，并随后开始应用于其他生物体的鉴定。在实际应用中，DNA指纹技术作为最好的法医学工具已经被广泛接受，可用于在刑事案件中确定犯罪嫌疑人、亲子纠纷、建立或证实一个人的身份。耗时的RFLP方法已逐渐被高通量的自动化过程取代。目前，利用PCR扩增，分析人类基因组10、16、18或更多位点上的短串联重复序列(STR)的数目(1991年发现(11))，已经实现了单细胞水平的鉴定。但是，不论STR还是可变数目的串联重复序列(VNTR)，都相对昂贵，因为这些方法需要使用复杂的设备，以及人工密集并且过程耗时的方法，比如Southern印迹杂交。自发突变(10)也可能会降低准确性和最终鉴定结果的确定性。此外，STR数据表明，突变的频率，特别是在癌症患者中，并不鲜见。因此，需要找到新的替代方法。单核苷酸多态性(SNP)基因型鉴定是在法医或个人身份识别中一种分辨率更高的方法，这种方法基于在不连锁位点上选择一定数量的SNP位点，其中每个位点的突变频率均低于VNTR或STR系统。本发明展示了一种利用SNP基因型鉴定的方法，快速、明确鉴定个体生物特征，包括人、动物、植物或其他生物。

HPV基因型鉴定

人乳头状瘤病毒(HPV)攻击粘膜细胞，具有高度多样性，世界范围内已报道的有大约200种不同的基因型，在不同种群中患病率各不相同。根据导致疾病的严重程度，人乳头状瘤病毒分为高风险株(HR)和低风险株(LR)。HR类型较常出现在宫颈的癌前病变或恶性病变，而LR类型多为良性病例(4)。每年有大约50万宫颈癌新发病例，死亡病例预计超过25万。因此，HPV感染与宫颈癌仍然是威胁全球女性的主要癌症(5)。基于这个原因，HPV筛查建议用于预防宫颈癌，因为它比细胞学方法更敏感(6,7)。