[发明专利]一种外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌，其分类命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia.Pastoris)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC NO.8924，保藏日期为2014年3月17日。

2.根据权利要求1所述的外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌，其特征在于，它是转化有重组突变质粒pPICZαA-fdh的分泌型巴斯德毕赤酵母菌，其中，所述的重组突变质粒pPICZαA-fdh是以醇氧化酶-1基因为启动子，并含有甲酸脱氢酶基因和Zeocin^TM抗性基因。

3.权利要求1所述的外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)应用PCR方法获得甲酸脱氢酶基因；

(2)构建重组质粒pPICZαA-fdh；

(3)将重组质粒pPICZαA-fdh用Sal I线性化后，电击转化入宿主菌巴斯德毕赤酵母中，即构成重组菌；

(4)将上述重组菌经过抗生素筛选和甲醇诱导表达后，即得出能够外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌。

4.根据权利要求3所述的外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的重组质粒pPICZαA-fdh是将甲酸脱氢酶基因插入到质粒pPICZαA中形成的重组质粒。

5.根据权利要求3所述的外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，将重组质粒pPICZαA-fdh用Sal I内切酶线性化后电击转化入宿主菌巴斯德毕赤酵母之前，先将其转化到大肠杆菌中进行扩增。

6.权利要求1所述的外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌在制备甲酸脱氢酶中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌CGMCC NO.8924在BMGY培养基中培养至OD₆₀₀为2～6，离心上清后用BMMY重悬至OD₆₀₀为1.0用以诱导表达，维持甲醇浓度为1v/v％，将所得的BMMY菌液诱导产酶96小时。