[发明专利]一种H9N2亚型禽流感病毒的转瓶培养方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种细胞的培养方法，具体来说是一种H9N2亚型禽流感病毒的转瓶培养方法。

背景技术：

禽流感(Avian Influenza，AI)是由正粘病毒科A型流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)引起的禽类高度接触性传染病，有16个HA亚型和9个NA亚型。根据禽流感病毒致病性的不同，可分为高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒。目前，我国的低致病性禽流感疫情主要以H9亚型为主。我国自1994年首次报道鸡群分离到H9N2亚型AIV以来，该亚型禽流感病毒广泛存在于我国辽宁、安徽、山东、广东、福建、江苏、河南、湖南、湖北、上海、广西、云南、四川、新疆等大部分地区。H9N2亚型禽流感病毒虽然不引起感染的禽类大量死亡，但是由于该病毒传播能力极强，存在范围极广，导致产蛋下降、免疫抑制病、与其它病原共感染时常导致高死亡率，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。进一步研究发现，H9N2亚型AIV能在不同宿主鸡、鸭、鹌鹑、鸽子间交互传播，进一步促进了该病毒的流行。同时，H9N2亚型AIV还可以感染猪、人(根据CDC公布的数据，1999年，2003年，2007年皆在香港发生感染事件)等。因此，H9N2亚型禽流感病毒在经济发展和公共卫生安全上呈现出越来越重要的地位，也越来越引起人们的广泛关注。

接种疫苗是预防禽流感发生与传播最有效的手段，对提高我国的禽病防治水平，对保障我国养禽业的健康发展有十分积极的意义。目前，中国国内的H9N2亚型禽流感疫苗均为鸡胚尿囊液灭活疫苗，这些H9N2禽流感病毒灭活苗疫苗毒株皆为2002年前分离获得的。研究发现，1998年-2006年间的毒株抗原性无变化，疫苗的保护率为100％。但2006年后，在疫苗的选择压力下，H9N2亚型的禽流感病毒毒株间抗原性发生了很大变化，疫苗的保护率在不断地下降。上海市动物疫病预防控制中心的一份2009年监测报告显示，在上海三大活禽批发市场中的样品H9亚型AIV平均阳性率为8.14％。其中在免疫了H9N2亚型AIV灭活苗且抗体合格率均大于70％的样品中分离到45株H9亚型AIV病毒(45/195),在免疫H9N2亚型AIV灭活苗的抗体合格率达到100％的样品中分离到了8株H9亚型AIV(8/90)。这些结果表明，现有的商品化H9亚型灭活疫苗免疫后，鸡只机体产生较高的免疫抗体，但尚不能完全阻止病毒复制，进行有效地保护。因而，市场需要用现行的H9N2亚型禽流感病毒流行株制备的商品疫苗。

目前，鸡胚是禽流感病毒疫苗生产和研究的主要材料，PR8病毒是一株鸡胚适应病毒株，目前也是鸡胚高产株之一，禽流感疫苗研制中常常将PR8的6个内部基因与流行毒株的HA和NA基因重组(6+2)，并将重组病毒作为疫苗株来提高病毒滴度。然而鸡胚培养流感病毒疫苗具有严重的缺陷，在疫情发生时，无法提供足够的鸡胚，因而无法在短期内扩大疫苗产品。病毒扩增会受到鸡胚中母源抗体的影响，使病毒滴度不能达到疫苗生产的需要；鸡胚培养病毒产生大量的废物，这些废物的处理不仅需要消耗大量的能源，而且也容易造成环境污染。细胞培养的流感病毒，可克服这些缺点，因而成为目前流感疫苗研制工作的主要方向之一。流感病毒灭活苗毒种的扩增慢慢地已由鸡胚向细胞转化，且越来越显示出经济效益及社会效益。人流感病毒在细胞疫苗的研究已取得重要突破，Baxter和Novartis等世界疫苗大公司，已用微载体细胞大规模培养技术研发成功人用流感疫苗，并通过欧盟批准上市，产生了巨大的经济效益。在动物流感病毒方面，由于细胞对流感病毒的敏感度不及鸡胚，因而细胞所制备的禽流感病毒滴度不够理想，进一步加剧了禽用疫苗的经济制约，到目前为止尚未有禽流感病毒的细胞疫苗产品上市。