[发明专利]一种血细胞分离管和单个核细胞的分离方法

说明书

本发明提供一种血细胞分离管以及分离单个核细胞的方法。所述的血细胞分离管由分离管管体、旋盖以及置于管体内的细胞分离隔膜和加样滑板(辅助加样装置)组成。本发明还公开了使用该血细胞分离管分离单个核细胞的方法，该方法基于细胞密度梯度离心分离细胞的原理，通过改变加样和取样方式使传统的、复杂的加样模式变成易于操作的方式。本发明提供的血细胞分离管及方法可以使临床医学检验和细胞生物学研究中的细胞分离过程更简化、操作更容易。

技术领域

本发明涉及生物医学领域的细胞分离技术。本发明提供的血细胞分离管以及分离单个核细胞的方法基于细胞密度梯度离心分离细胞的原理，通过改变加样和取样方式使传统的、复杂的加样模式变成易于操作的方式。

背景技术

在临床医学检验中，针对特定细胞功能和生物学特性的检查常常涉及到细胞的分离技术，从外周血液和各种体液(胸水、腹水、心包积液等)中分离单个核细胞是体外进行淋巴细胞免疫学研究和细胞学实验的重要前处理步骤，分离的目的细胞的质和量是保证后续实验可靠性的重要环节。

外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)是参与机体免疫应答反应的一类重要免疫细胞群。PBMCs主要包含淋巴细胞和单核细胞，PBMCs中大部分(80％～90％)为淋巴细胞，其余成分是单核细胞，淋巴细胞包括T淋巴细胞和B淋巴细胞两大类，这两种免疫细胞按其细胞表面标志和细胞功能又分为不同的细胞亚群，按照淋巴细胞表面标志T淋巴细胞有CD3+、CD4+、CD8+、CD28+、CD38+、CD45+细胞等等，按照功能分还有辅助T细胞(helper T cell，Th)、效应T细胞(Effector T cells，Te)、迟发性变态反应T细胞(Delayed type hypersensitivity T cells，Td)和细胞毒性T细胞(Cytotoxic Tcells，Tc)等等；B淋巴细胞有B1、B2两种亚型，对不同淋巴细胞亚群的分离、鉴别以及功能的研究对疾病的诊断乃至治疗都有十分重要的临床意义。

任何疾病的发生、发展都有相应淋巴细胞的数量、形态或者功能的改变，从细菌、病毒等一些病源微生物对人类的感染到肿瘤的发生以及一些免疫缺陷病、自身免疫性疾病和遗传性疾病等许多疾病都有淋巴细胞参与的应激性免疫反应，表现为某些细胞亚群数量的改变、淋巴细胞膜表面标志物的变化或者引起细胞功能的变化(细胞因子的分泌或抗体的产生)，例如结核分枝杆菌侵入人体后会迅速被体内的淋巴细胞所识别，从而引起相应的细胞免疫反应，导致初始淋巴细胞在结核抗原刺激下转化成效应T淋巴细胞，这些效应T淋巴细胞再次受到结核杆菌特异性抗原刺激后会产生相应的细胞因子γ-干扰素，体外检测这些分泌γ-干扰素的效应T淋巴细胞对于诊断结核分枝杆菌感染具有重要的临床意义。

淋巴细胞的分离方法有多种，这些分离方法的原理是根据各种细胞间的密度差异、细胞的粘附特性或者细胞膜表面标志的不同等物理的和生物学性能而设计的，主要方法包括粘附分离法、密度梯度离心法、免疫磁珠法和流式细胞仪法等。

粘附分离法是根据细胞对玻璃、尼龙棉等不同材质接触表面的粘附差异分离细胞的，被分离的混合细胞流经吸附物体表面时粘附性高的细胞附着在吸附物表面，粘附性低的随液流被冲走。中国专利CN87102643A公布一种基于细胞粘附性质设计的细胞分离器，该专利对细胞吸附材料的制作进行优化，目的是提高分离细胞的纯度和比例。粘附分离法分离目的细胞的回收率除了与选择的吸附材料有关外，还与分离时控制输入细胞的流速有关，为此中国专利CN200520134012公布了一项微流体细胞分离装置的制作方法，该装置在控制被分离的混合细胞流速方面做了一些尝试。粘附分离法需要控制被分离混合细胞的输入速度，操作比较麻烦，这种方法细胞分离纯度不高、回收率也低。