[发明专利]一种提取土生隐球酵母线粒体的方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种线粒体的提取方法，特别涉及一种用于提取土生隐球酵母线粒体的方法。

背景技术

线粒体是细胞中一种重要的细胞器，存在于绝大多数活细胞中，线粒体在细胞代谢中扮演着重要的角色，它的主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。因此，研究线粒体内外膜，呼吸链酶及线粒体DNA等成分的结构、功能及理化性质已经成为细胞生物学研究中的重要课题，而提取有活性的线粒体则是这些研究的基础。

目前提取线粒体的方法很多，包括蔗糖密度梯度离心法、差速离心法和试剂盒提取方法。蔗糖密度梯度离心法属于传统方法，该法成本低，但是费时费力，而且需要超速低温离心机，而提取线粒体的试剂盒价格比较昂贵。差速离心法只适用于酿酒酵母线粒体的提取，用于土生隐球酵母提取时，对细胞破壁比较困难，原生质体得率低，进一步导致无法得到线粒体。

发明内容

本发明目的在于提供一种操作简便快捷的方法，从土生隐球酵母细胞材料中提取高质量的、活性强的线粒体，适用于实验应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的操作步骤为：

（1）将GM（葡萄糖培养基）或者YPD（酵母膏胨葡萄糖培养基）液体培养基中培养到对数生长期的土生隐球酵母离心收集菌体，用pH 7.5的0.05mol/L Tris缓冲液洗涤三遍，然后加入预处理缓冲液，在25-30℃下，100-200 rpm摇60-120 min；

（2）将上述溶液离心弃去上清，沉淀用0.01mol/L PBS洗两次，然后离心收集沉淀；

（3）向沉淀中加入酶解缓冲液，混匀后在温度为28-36 ℃，转速100-200 rpm条件下处理2-6 h，取样在显微镜下观察原生质体形成情况，取样的多少依据菌体量多少来定，使形成的原生质体在显微镜下不重叠为准；

（4）在显微镜下观察到大部分菌体都破壁形成了原生质体后，离心去掉酶解缓冲液，用0.01mol/L PBS洗一次，取沉淀，加入原生质体裂解液，混匀，然后加入5倍体积的玻璃珠涡旋振荡10-30 min，取样在显微镜下观察原生质体破碎情况；

（5）于4 ℃，1200-1800 g离心10 min去沉淀，用原生质体裂解液重复洗涤2-3次，每次均弃去沉淀收集上清溶液，将所得上清液在4 ℃，12000-20000 g离心20 min收集沉淀；

（6）加入线粒体洗涤缓冲液，在4 ℃，1200-1800 g离心10 min去沉淀；

（7）将上述上清液在4 ℃，12000-20000 g离心20 min后收集沉淀，所得沉淀即为线粒体，

加入线粒体洗涤缓冲液悬浮线粒体；

（8）将线粒体悬浮液与詹纳斯绿B应用液按1:1比例混匀，室温染色15 min后显微镜检下观察，线粒体为蓝绿色，呈椭圆形或卵圆形颗粒状。

本发明中所述预处理缓冲液为pH8.0，含2mmol/L -0.1mol/L EDTA、0.5-1% β-巯基乙醇的0.01mol/L PBS溶液。

本发明中所述酶解缓冲液为pH7.4，含20-60 mg/mL蜗牛酶，2-5 mg/mL纤维素酶、0.35mol/L -0.9mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液。

本发明中所述原生质体裂解液为pH7.5，含10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L -0.1mol/L EDTA、0.35mol/L -0.9mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液。

本发明中所述线粒体洗涤缓冲液为pH7.5含10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L -0.1mol/L EDTA、0.35mol/L -0.9mol/L 山梨醇的0.01mol/L PBS溶液。

1%詹纳斯绿B母液：取 50mg詹纳斯绿B粉末溶解于5mL Rioger溶液 (NaCl 0.85g，KC1 0.25g，CaCl₂ 0.03g，用去离子水定容至100mL)，稍加热(30～40℃)溶解，过滤，即得。

詹纳斯绿B应用液：取1%詹纳斯绿B母液 1mL，加入49mL Rioger溶液，混匀即得，现配现用；

上述配制缓冲液的PBS均为0.01mol/L的1×PBS溶液。