[发明专利]一种制备猪圆环病毒2型敏感细胞系的方法、及其制备的细胞系和应用

权利要求书

1.一种猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将猪肾细胞按照有限稀释法进行细胞克隆和亚细胞克隆，获得亚细胞克隆株；

2)选择对猪圆环病毒2型感染率最高的猪肾细胞的亚克隆株进行细胞培养；

3)将步骤2)培养成单层的猪肾细胞亚克隆株加入孵育剂进行孵育；

4)弃去步骤3)的孵育剂及脱落细胞；

5)将步骤4)剩余的贴壁细胞经消化传代，以细胞生长液进行培养，即得猪圆环病毒2型敏感细胞系。

2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法，其特征在于，步骤1)使用的猪肾细胞为未被猪圆环病毒2型感染的猪肾细胞，经胰蛋白酶消化为单细胞后进行滴度稀释，分别在37℃5％CO₂的条件下培养于96孔细胞培养板中培养至肉眼可见细胞克隆后，进行亚细胞培养，获得亚克隆细胞株。

3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法，其特征在于，步骤2)为将猪肾细胞亚克隆株接种到96孔细胞培养板中，接种猪圆环病毒2型于37℃5％CO₂的条件下培养2小时，使用间接免疫荧光法检测感染病毒最多的细胞，选择对猪圆环病毒感染率最高的猪肾细胞的亚克隆株。

4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖、干扰素或脂多糖；更优选地，所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖；最优选地，所述孵育剂为浓度为300mmol/L的D-氨基葡萄糖。

5.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述孵育剂孵育时间为25-35分钟；更优选地，所述的孵育时间为30分钟。

6.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系的制备方法，其特征在于，优选地，步骤(5)所述的细胞生长液为含50～100μg/mlDEAE-Dextran和5％体积百分比的胎牛血清的MEM。

7.一种使用权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系用于高滴度的猪圆环病毒2型的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系用胰蛋白酶消化后，同步接种猪圆环病毒2型，37℃含5％CO₂温箱中培养4-5d，细胞脱落病变达80％以上，收获即可获得高滴度的猪圆环病毒2型病毒液。

8.根据权利要求7所述的高滴度的猪圆环病毒2型的制备方法，其特征在于，所述的收获的高滴度猪圆环病毒2型病毒液滴度为≥10^7.0TCID₅₀/ml。

9.一种使用权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)培养猪肾克隆细胞；

2)增殖病毒；

3)收获病毒，灭活，加入佐剂制备灭活疫苗。

10.一种使用权利要求1所述的猪圆环病毒2型敏感细胞系生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗。