[发明专利]miRNA393a基因预报水稻白叶枯病的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及miRNA393a基因预报水稻白叶枯病的方法。

背景技术

水稻是我国主要粮食作物，白叶枯病是水稻两大主要病害之一，属世界性病害，亚洲稻区发生尤重。白叶枯病发病率高、传染快，发病稻田减产20-30％，甚至50％。与大部分病害一样，白叶枯病发病早期防治效果较佳。发病中后期，病菌已大量繁殖，已对水稻造成了伤害，防治效果较差。由此可见，早期预报是水稻白叶枯病预防的关键所在。

传统水稻白叶枯病预报主要依据气候、天气、品种抗性、氮肥施用情况、以及病害历史等进行推测，也可依据田间水稻白叶枯病症状表现，对后期病情发展进行预报。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：

根据天气、气候、品种抗性、栽培现状和历史等进行的预报结果是很模糊的，可说明在一定区域与时间范围内病害发生的概率，但不能预报病害发生的具体时间与地点，预报结果的可应用性较差。例如，高温高湿常作为水稻白叶枯病的流行预报的气候条件，但不能确定高温高湿下病害是否一定出现、在那块田出现、在那天出现。由于以上的不确定性，农民不能决定是否开始防治白叶枯、对哪块田进行防治、以及何时防治。同时，病症出现表明白叶枯病已进入中后期，病菌已大量繁殖，白叶枯病流行已难以避免，使得利用病症调查进行预报的工作也无太大实际意义。

发明内容

为了解决现有技术中水稻白叶枯病预报不及时、不准确的缺点，本发明实施例提供了一种miRNA393a基因预报水稻白叶枯病的方法。所述技术方案如下：

选取9311水稻品种作为待测水稻和对照水稻；

栽培所述待测水稻和所述对照水稻；

分别分离所述待测水稻和所述对照水稻中的总miRNA基因；

分别检测所述待测水稻和所述对照水稻中的所述总miRNA基因中的miRNA393a基因的表达量，所述miRNA393a基因的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；

根据所述待测水稻和所述对照水稻中的miRNA393a基因的表达量，判定实验是否成功，若成功，则进一步判定所述待测植株是否感染白叶枯病。

具体地，所述栽培所述待测水稻和所述对照水稻时，所述对照水稻在栽培时采用保护性栽培措施并防治白叶枯病，除所述保护性栽培措施和防治白叶枯病外，所述对照水稻与所述待测水稻的栽培条件保持一致。

进一步地，所述保护性栽培措施包括对土壤隔离、水源隔离和空间隔离。

具体地，在上午8：55～9：05利用所述待测水稻和所述对照水稻的相同叶片的相同部位进行所述总miRNA基因的分离。

具体地，采用实时定量PCR方法，检测所述miRNA393a基因在所述待测水稻和所述对照水稻中的表达量。

进一步地，所述实时定量PCR方法的前处理步骤包括：

利用分光光度计测定并获得分离的所述总miRNA基因的浓度；

向所述总miRNA基因中加入外源参考miRNA基因，得到第一混合液，所述外源参考miRNA基因的加入量为所述总miRNA基因质量的0.05％，所述外源参考miRNA基因的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；

将所述总miRNA基因和所述外源参考miRNA基因的5’端与3’端连接，得到环化的所述总miRNA基因和环化的所述外源参考miRNA基因的混合液；

将所述环化的总miRNA基因和所述环化的外源参考miRNA基因的混合液进行逆转录，得到的逆转录产物用于进行所述实时定量PCR检测。

进一步地，所述采用实时定量PCR方法，检测所述miRNA393a基因在所述待测水稻和所述对照水稻中的表达量，包括：

将2μl所述逆转录产物、3μl浓度为1μM的引物、10μl定量PCR混合物和0.4μl50倍的ROX荧光校正染料混合均匀，得到第二混合液，将所述第二混合液在实时定量PCR仪中进行反应，所述反应程序为：50℃2分钟；95℃10分钟；95℃45秒，56℃45秒，66℃30秒，67℃30秒，共45个循环，其中，66℃30秒和67℃30秒这两步在每循环一次后分别增加0.1℃和0.2℃，在每一次循环的最后一步收集荧光信号，所述荧光信号的强弱用于衡量所述表达量的多少；