[发明专利]SFRP1蛋白的适配子及其筛选方法和应用

说明书

背景技术

寡核苷酸适配子是由SELEX技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)生物文库技术筛选获得的，该技术的原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度在20-100个碱基左右。利用单链寡核苷酸分子构像灵活多变的特性，将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留以空间构像与靶分子结合的寡核苷酸，经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该靶子特异结合的寡核苷酸序列得到富集，最终获得多种靶分子的特异寡核苷酸适配子，即aptamer。利用SELEX技术筛选获得的aptamer识别分子的模式与蛋白抗体类似，但与蛋白类抗体相比，核酸类配基具有更多的优越性，如不受免疫条件和免疫原性限制，可体外人工合成，变性与复性可逆，可修饰并有利于长期保存和室温运输等。更重要的是，aptamer比抗体具有更高的特异性，甚至能识别单抗不能区分的蛋白质分子。而且aptamer的靶分子非常广泛，小至染料分子，大至完整的病毒颗粒和细菌病原体，甚至完整的细胞也可以通过消减SELEX技术筛选出高亲和力的寡核苷酸适配子。

SFRP，分泌型Frz相关蛋白(secreted frizzled-related proteins)，含有一个富含半胱氨酸的结构域(cysteine rich domain，CRD)，但缺少七次跨膜域，它可能与卷曲蛋白(frizzled，Frz)竞争结合Wnt蛋白，从而抑制Wnt蛋白的过量表达。Wnt是一类分泌型糖蛋白，对人体正常细胞增殖起调整促进作用。近期实验发现，抑制这种蛋白质作用的基因SFRP发生异常时，Wnt蛋白质的机能会随之出现异常，使得癌细胞不断增殖，导致发生大肠癌。当把正常的SFRP基因注入癌细胞后，就会控制癌细胞增殖和杀死癌细胞。研究表明，90％的大肠癌患者与SFRP基因异常有关。因此，针对SFRP1蛋白特异性的检测变得尤为重要。

基于以上考虑，本发明以SFRP1蛋白为目的靶蛋白，采用SELEX技术获得了15条针对SFRP1蛋白特异的aptamer，组合应用能够迅速、敏感、特异的检测到SFRP1蛋白。由于单链DNA寡核苷酸适配子性能稳定、合成方便且廉价、经修饰后可直接用于荧光或化学发光、发色方法检测靶绑带，因此操作简单、直接。

发明内容

本发明的目的在于提供不仅具有检测快速、操作简单、稳定性高于抗体等特点，而且制备方法容易、制备周期较短的一组能识别SFRP1蛋白的寡核苷酸序列及其制备方法。

所述能识别SFRP1蛋白的寡核苷酸序列，包括SEQ ID No.2-16，且采用其中的一条寡核苷酸序列就能完成对SFRP1蛋白的识别检测；

所述一组能识别SFRP1蛋白的寡核苷酸序列的制备方法包括以下步骤：

1、合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库(5′-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC----

N35----GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3′)，其中N35为35个随机寡核苷酸；

2、将寡核苷酸文库分别与SFRP1蛋白混合后进行SELEX筛选，获得适配子富集文库；

3、SELEX筛选完成后，对获得的适配子富集文库进行克隆测序；

4、选择测序结果中出现的高拷贝ssDNA，进行亲和特异性的验证，筛选获得能识别SFRP1蛋白的寡核苷酸序列。

具体实施方式

实施例1

1、SFRP1蛋白的制备

采用本领域技术人员熟知的酵母重组表达的方式获得SFRP1蛋白，该蛋白序列如SEQ ID NO：1所示；蛋白溶液的浓度为15mg/ml。

2、文库和引物的合成

2.1、合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库(5′-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC----N35----GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3′)，其中N35为35个随机寡核苷酸；

引物P1：TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC；

引物P2：CCCTCTGGGGTCTCCCTCTTGTGC。

2.2、适配子的SELEX筛选，具体方法如下：

2.2.1 ssDNA与SFRP1蛋白的结合、分离，具体方法如下：