[发明专利]一种桉树遗传转化与再生方法

说明书

技术领域

本发明属于植物的遗传转化与再生方法，特别涉及一种桉树的遗传转化与再生方法。

背景技术

桉树起源于澳大利亚及附近岛屿，是桃金娘科(Myrtaceae)桉树属(Eucalyptus)的总称，现有800多个种，137个亚种，是一种集观赏、用材、纸浆原料、药用于—体的优良树种。由于桉树具有种类多、生长快、耐瘠薄、干形好、用途广等特点，在热带和亚热带地区有广泛的栽培，目前桉树人工林面积已超过世界人工林面积的五分之一。随着社会经济的发展，木材的供需矛盾与日俱增，纸浆需求量也逐渐加大，木材供应出现巨大缺口。因此，发展替代天然林实木材的优质速生丰产桉树人工林显得十分紧迫。但因病虫害、冻害、人工成本高、树种间性状差异大等问题，严重影响了桉树人工林的进一步发展，解决这些问题根本而且有效的途径是选育良种。由于林木生长周期长，遗传杂和性高，许多性状属于多基因控制的数量性状，常规的育种手段难以满足定向培育桉树新品种的要求。基因工程技术具有高效性和针对性，可弥补常规育种技术的不足，加速优质、高抗桉树新品种的选育进程。

除种质转化法等少数转化方法外，其它所有植物转基因方法都需要建立一个有效的再生体系。不同的转化方法根据操作对象不同需要建立相对应的再生体系，如根癌农杆菌介导法要求通过愈伤组织或原生质体或体细胞胚形成再生植株；而基因枪法则对操作对象要求较低，根、茎、叶、培养细胞愈伤组织、种子等都可以作为外植体；而化学法、电穿孔法以及脂质体包裹法需要的是原生质体。在桉树中，主要是通过愈伤组织再生、体胚再生、原生质体再生等再生体系进行转基因研究。1991年Teulieres C等首次在冈尼桉(E.gunnii)原生质体上转化报告基因。陈振荣等利用巨尾桉的叶片为材料进行转基因研究，发现MS培养基添加1mg/L kinetin及10mg/L IBA可以诱导愈伤组织的形成，MS培养基添加IBA或NAA时可以诱导根的形成，并初步利用含有40mg/L Kan的培养基，筛选到了含有NPT(neomycin phosphotransferase)和GUS(β-glucuronidase)基因的植株，转化率高达31.3％。张景宁报道，柞蚕抗菌肽对桉树青枯假单胞菌有杀灭作用。邵志芳等以尾叶桉叶盘为材料，在根瘤农杆菌的介导下将柞蚕抗菌肽D基因转入了尾叶桉，并进一步通过诱导和筛选，获得了阳性植株，对青枯病具有较强的抵抗性。曾富华等利用尾叶桉无菌苗下胚轴为外植体进行遗传转化和再生，获得了含有外源基因的桉树转基因植株。Kazuaki等在农杆菌的介导进行遗传转化，将紫苏的柠檬烯合成酶基因转入到桉树幼苗的下胚轴中，经过一系列的组织培养和筛选后，获得了含有目的基因的植株，其柠檬烯含量比野生型桉树高出16～35倍。Bloksberg等人从辐射松(Pinus radiata)中分离出了木质素合成途径中的OMT和CCR基因，通过农杆菌的介导转入到桉树的植株中。2007年赖家业等人在建立的尾巨桉(E.urophylla×E.grandis)无性系高频再生体系的基础上，利用GUS染色组织分析法探讨了各因素对尾巨桉茎段遗传转化的影响，转化率最高也只有26％。到目前为止，科研人员先后进行了柠檬桉(E.citriodora)、蓝桉(E.globulus)、赤桉(E.camaldulensis)、巨桉(E.grandis)、小套桉(E.microtheca)、黄皮桉(E.ochrophloia)及边缘桉(E.marginata)等的遗传转化的初步研究。现已获得转基因桉树的有蓝桉、赤桉和巨桉。Harcourt用农杆菌介导将抗除草剂和抗虫基因转入桉树，获得了多重抗性的转化植株。

桉树萌芽条是桉树采伐后的木桩萌发出的枝条。桉树主干被砍伐后，主干中的形成层细胞和射线细胞继续保持分裂，在根部充足营养成分和激素的供给下逐渐形成芽原基，进而发育成不定芽，并最终长出萌芽条。桉树萌芽条由于具有分生能力强，生长迅速，并且能够稳定遗传母树的优良特性等优点，常常作为桉树组织培养的首先原材料被广泛使用。综上所述，国内外以多种桉树的不同部位为材料进行了遗传转化，并获得了相关的转基因植株，但是现有的桉树遗传转化技术具有周期长、工作量大、适用范围窄、转化效率低等缺点，尚未见用桉树萌芽桩为外植体进行遗传转化并获得成功的例子。

发明内容

本发明提供了一种桉树遗传转化与再生的方法，利用桉树萌芽桩的生长特性作为外植体进行遗传转化和再生，达到加快桉树分子育种进程和批量生产转基因植株的目的。

为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案如下：