[发明专利]一株以葡萄糖为底物合成粘康酸的大肠杆菌工程菌有效

专利信息
申请号: 201410310643.6 申请日: 2014-07-01
公开(公告)号: CN104099284B 公开(公告)日: 2018-12-04
发明(设计)人: 郑璞;王杰 申请(专利权)人: 江南大学
主分类号: C12N1/21 分类号: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/44;C12R1/19
代理公司: 北京爱普纳杰专利代理事务所(特殊普通合伙) 11419 代理人: 何自刚;王玉松
地址: 214122 江*** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 葡萄糖 合成 粘康酸 大肠杆菌 工程
【说明书】:

本发明公开了一株以葡萄糖为底物合成粘康酸的大肠杆菌工程菌,属于生物技术领域。本发明向大肠杆菌中引入了2,3‑二羟基苯甲酸(2,3‑DHB)至粘康酸(MA)的代谢途径,并强化了大肠杆菌自身从葡萄糖到2,3‑DHB的代谢途径。本发明提供的新途径所需要的外源基因少,减少了宿主菌表达外源基因的负担和外源基因的不兼容问题。此外,宿主菌不是营养缺陷型,无需外源添加昂贵莽草酸或其他芳香族氨基酸,摇瓶发酵粘康酸产量为1.15g/L。

技术领域

本发明涉及一株以葡萄糖为底物合成粘康酸的大肠杆菌工程菌,属于生物技术领域。

背景技术

粘康酸,又称己二烯二酸,由于可以被用作生产生物塑料的前体和平台化合物而被广泛研究。这些产品主要有商业化的大宗化学品如己二酸,对苯二甲酸和偏苯三酸,用于制造尼龙66,聚酯合成纤维,对酞酸二甲酯,工业塑料,药品,增塑剂和化妆品等等。全世界范围内己二酸的消耗已经达到了300万吨,我国的己二酸需求量每年都在增长,聚氨酯生产企业的需求量每年增长都在10%以上。传统的粘康酸化学生产方法主要依赖于不可再生的石油原料和高纯度的重金属催化剂,这导致严重的环境污染,石油消耗和昂贵的分离加工过程。因此,通过一种可持续的,环境友好的,依赖于廉价糖类的低成本的生物合成方法变得尤为迫切。

一些微生物可以依靠某些芳香族化合物如苯甲酸等代谢产生粘康酸,例如Acinetobacter sp.,Pseudomonas sp.,Sphingobacterium sp.和Cinctura sp.等。但是还没有发现一种微生物可以利用简单碳源如葡萄糖直接生产粘康酸。Draths和Frost最早通过敲除了大肠杆菌中的莽草酸脱氢酶基因来阻断莽草酸途径,并且利用三个外源基因,分别是3-脱氢莽草酸脱水酶(DHS dehydratase,AroZ),原儿茶酸脱羧酶(PCAdecarboxylase,AroY)和邻苯二酚1,2-双加氧酶(catechol1,2-dioxygenase,CatA)来组成异源合成途径,该途径从葡萄糖经3-脱氢莽草酸、原儿茶酸,邻苯二酚合成粘康酸。通过发酵条件的优化,粘康酸的含量达到了36.8g/L(Biotechnology progress,2002,18(2):201-211)。然而,由于重组菌是芳香族氨基酸和芳香族维生素的营养缺型,在培养基中要添加苯丙氨酸,酪氨酸,色氨酸,对氨基苯甲酸,对羟基苯甲酸和2,3-二羟基苯甲酸等菌体才能正常生长,这些芳香族化合物价格昂贵,限制了利用此菌株工业化生产粘康酸。Curran和Weber研究团队在酿酒酵母中,构建相同的代谢途径,粘康酸的产量分别达到了1.5mg/L和140mg/L(Metabolic engineering,2013,15:55-66;Applied and environmentalmicrobiology,2012,78(23):8421-8430)。但是产量都低,还不适合用来工业化生产。中国专利CN103667166A公布了采用同样的代谢合成途径,通过对途径中关键酶3-脱氢莽草酸脱水酶(DHS dehydratase,AroZ),原儿茶酸脱羧酶(PCA decarboxylase,AroY)和邻苯二酚1,2-双加氧酶(catechol1,2-dioxygenase,CatA)进行密码子的优化,及设计组成型启动子和终止子,以及重组菌的发酵条件优化,摇瓶发酵24小时,发酵液中粘康酸含量1.5g/L。7.5L发酵罐发酵84小时,粘康酸最高含量达到52g/L,有应用前景,但是在培养基中加入了一定量的莽草酸,以弥补大肠杆菌芳香族氨基酸的营养缺陷型,莽草酸价格非常昂贵,增加了粘康酸的生产成本。

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