[发明专利]利用可视化抗原芯片筛选单克隆抗体杂交瘤细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种筛选单克隆抗体杂交瘤细胞的方法，具体来说是一种利用可视化抗原芯片筛选单克隆抗体杂交瘤细胞的方法。

背景技术

生物芯片技术是上世纪90年代初发展起来的一种高通量、大规模并行分析检测技术，曾被Science杂志两度评为年度十大科技突破之一，它是利用分子间特异相互作用的原理，将多种技术(如生物化学、微加工、微电子、计算机等)融为一体的一项分析检测技术。与传统分析检测方法所不同的是，它形成的微阵列使生化分析反应过程高度集成于某一载体之上，高通量地分析检测成百上千种DNA、RNA、多肽、蛋白质等分子。目前常见的生物芯片有：基因芯片、蛋白质芯片、糖芯片以及其他小分子生物芯片。

蛋白质芯片是将各种蛋白质(如抗原、抗体)、多肽以及受体、配体等有序固定于某一载体(如多孔膜、凝胶、玻片、纳米微珠和微孔板)之上，以分析检测样品中能与之特异相互作用的成分。虽然蛋白质芯片是在蛋白质组学的研究背景下产生的，但其应用不仅仅只局限于蛋白质组学。凡是有关抗体—抗原、蛋白质—蛋白质、蛋白质—核酸、蛋白质—脂类、蛋白质—小分子以及酶与底物相互作用的研究中，蛋白质芯片技术均有其独特的用途。目前主要应用于蛋白质组学、食品检验、疾病诊断、药物筛选、农林畜牧业、司法鉴定等领域。

单克隆抗体技术，是指将某种抗原诱导产生的特异性B淋巴细胞和骨髓瘤细胞经融合，形成杂交瘤细胞，并分离筛选出单个杂交瘤细胞，再将其扩增，最终分离纯化制得单克隆抗体。杂交瘤细胞具有双重特性，既能如骨髓瘤细胞般持续繁殖，又能如B淋巴细胞般分泌针对单一抗原决定簇的特异性抗体，即单克隆抗体。尽管单克隆抗体越来越广泛地应用于各个研究领域，但是自1975年问世以来，制备单克隆抗体一直沿用传统方法，成为这一经典技术发展的瓶颈。制备单克隆抗体包括抗原制备、动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、亚克隆、冻存复苏、杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定以及单克隆抗体的大量生产等一系列复杂步骤，一般要花费6个月以上的时间。其中杂交瘤细胞的筛选这一步骤最为耗时。

目前筛选单克隆抗体杂交瘤细胞，都是采用间接酶联免疫法(间接ELISA法)筛选出无交叉反应、高亲和力的杂交瘤细胞，即把靶抗原以及不能有交叉反应的靶抗原类似物包被在96孔酶标板上，逐一用融合后的阳性杂交瘤细胞去筛选每种抗原，选择那些只针对靶抗原有阳性反应，而放弃那些和靶抗原反应弱，或者和靶抗原类似物有交叉反应的杂交瘤细胞。而且要获得特异性高、亲和力高、稳定性好的杂交瘤细胞通常需要3、4轮的筛选，这种逐一筛选的方法筛选周期长、成本高，需要酶标仪、洗板机等专业设备，而且实验人员需要丰富的经验。例如，就食源性致病菌单克隆抗体的制备来说，在杂交瘤细胞制备过程中，通常一次融合，一般会有1000多孔杂交瘤细胞，融合较好的时候100％的孔里都有杂交瘤细胞生长，但是最终只有不到10％的孔里面含有目标杂交瘤细胞，所以要从如此多的杂交瘤细胞中筛选出目标杂交瘤细胞，其筛选量是非常巨大的。一轮筛选通常需要进行几十次间接ELISA实验，花费数周时间，这大大增加了单克隆抗体的制备周期，也增加了生产成本。就杂交瘤细胞特异性筛选这一试验，通常需要对实验前期所获得的几十株阳性杂交瘤细胞的几十种靶抗原以及不能有交叉反应的靶抗原类似物进行交叉反应的试验。最终，限制了单克隆抗体制备技术的发展以及相关免疫学鉴定技术体系的建立与发展。

发明内容

针对上述现有单克隆抗体杂交瘤细胞筛选技术中存在的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种利用可视化抗原芯片筛选单克隆抗体杂交瘤细胞的方法，所述的这种方法解决了现有单克隆抗体杂交瘤细胞筛选技术周期长、成本高的技术问题。

本发明一种利用可视化抗原芯片筛选单克隆抗体杂交瘤细胞的方法，包括如下步骤：

1)一个制备用于筛选单克隆抗体杂交瘤细胞的抗原芯片的步骤，在所述的制备抗原芯片的步骤中，将筛选单克隆抗体杂交瘤细胞所需的靶抗原或者靶抗原类似物按阵列方式点样固定于基片上，制成抗原芯片；

2)将制备好的抗原芯片浸于芯片封闭液中进行封闭处理；

3)将封闭处理后的抗原芯片浸于单克隆抗体制备前期所获得的阳性杂交瘤细胞产生的细胞上清液中，进行免疫杂交反应；

4)将上述处理好的抗原芯片浸于过氧化物酶、或者碱性磷酸酶标二抗中，进行免疫杂交反应；

5)将免疫杂交后的抗原芯片浸于二氨基联苯胺、或者联苯胺、或者氯化硝基四氮唑兰显色液中，进行可视化显色反应；