[发明专利]一种不对称菁染料化合物及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种不对称菁染料化合物，及其作为荧光淬灭剂尤其是ROX通道荧光淬灭剂的应用。

(二)背景技术

核酸杂交技术是分子生物学的基本技术之一，可以用来对遗传疾病进行诊断，人体鉴定，微生物鉴定，亲子鉴定，近年来正逐渐用于病毒的特异，敏感和快速诊断。

核酸杂交技术一个很重要的方面是对杂交的探测，一个经常使用的工具是荧光寡核苷酸探针，一种特别有用的荧光探针类型是自淬灭探针，此探针包括了报告染料和淬灭染料，二者之间通过荧光共振能量转移(FRET)过程发生作用。尽管使用该基序的不同探针的设计可能在细节上存在差异，FRET探针含有连接到寡核苷酸上的荧光团和淬灭剂。

实时荧光定量PCR技术通过检测PCR产物中荧光信号强度来达到定量的目的，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。

荧光染料广泛用于生物学研究和诊断，荧光染料优于常规的放射性材料，因为荧光染料通常具有足够的检测灵敏度，廉价并且无毒，具有可区分颜色范围的各种荧光团使得能平行检测多种生物学靶标的多重实验更加可行，在体外和体内描述不同生物学靶标之间在空间和时间上的关系常要求能平行显示多个靶标。此外，大量荧光染料为进行高通量和自动化试验打开了新的通道。

ROX荧光染料现有技术中一般用于调整PCR加样误差所引起的PCR管与管之间的差异，目前还未有ROX通道淬灭剂被广泛使用。

(三)发明内容

本发明的目的是提供新的淬灭剂，其具有低背景信号和/或高淬灭功效。本发明提供一种不对称菁染料的荧光淬灭剂化合物，可有效淬灭ROX的荧光。

本发明采用的技术方案是：

一种不对称菁染料化合物，其结构如式(I)所示：

式(I)中：

R₁为-H、-NO₂、-OH或C1～C4烷基；

R₂为-H、C1～C4烷基、苯基或卤素取代苯基；

R₃、R₄为-H、C1～C4烷基或活性基团，并且R₃、R₄中至少一个为活性基团。

所述活性基团是指可以与其它化学基团反应而形成共价化学键的基团，在合适的反应条件下具有共价活性，是与其它底物连接的点，包括亲电、亲核和光活性基团。

本发明化合物是具有化学活性和可以被至少一个活性基团取代的，活性基团的功能是作为连接其它部分的位点，此处活性基团与载体或者固相支撑物上的合适的活性基团进行化学反应。

典型的，本发明化合物包含的活性基团，可以是丙烯酰胺，羧酸的活化酯，酰基叠氮，酰腈，醛，酮，烷基卤，烷基磺酸酯，酸酐，苯胺，氨基，芳基卤，叠氮，氮丙碇，硼酸酯，重氮烷，环氧化物，卤代乙酰胺，卤代三嗪，亚胺基酯，异氰酸酯，异硫氢酸酯，马来酰亚胺，亚磷酰胺，磺酸酯，磺酰氯，顺铂等。一般而言，活性基团可以为羧基，羧酸的丁二酰亚胺酯，肼，氨基或马来酰亚胺。

本发明化合物至少含有一个活性基团选择性的与氨基反应，这个具有氨基反应活性的基团可以是琥珀酰亚胺酯，磺酰卤，四氟苯酯或异硫氰酸酯。因此，本发明化合物可以与样品中含有氨基的分子形成共价键。或者，本发明化合物也可以至少含有一个可以与硫醇基团反应的活性基团，具有硫醇基团反应活性的基团可以是马来酰亚胺，卤代烷或卤代乙酰胺酯。又或者，所述活性基团还可以是可以与羟基基团反应的基团，例如亚磷酰胺。

优选的，所述活性基团为下列之一：羧酸(-COOH)，羧酸的丁二酰亚胺酯()，肼(-NH-NH₂)，氨(-NH₂)，马来酰亚胺亚磷酰胺

所述化合物(I)更优选为下列之一：

合成本发明不对称箐染料化合物的通用方法如下式所述(其中用R₅表示)：

具体方法如下：季胺化的苯并噻唑衍生物(III)与4-甲基喹啉季胺盐例如化合物(II)，在吡啶中回流，反应完毕后，将DMF倒入搅拌的水中，加入盐酸酸化，过滤，用稀盐酸洗涤，干燥，即得。