[发明专利]用于检测牛CWC15基因隐性致死突变的引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及家畜遗传缺陷的分子诊断技术，具体地说，涉及一种用于检测牛CWC15基因隐性致死突变的特异性引物及试剂盒。 

背景技术

娟珊牛是一个著名的小型乳用牛品种，具有乳成分高、耐热性好、综合效益高等优点。近年来，我国一些大型奶业企业，陆续进口娟珊牛，丰富现有奶牛品种资源，生产特色牛奶。然而，由于娟珊牛在世界范围内都是一个小品种，种质来源较为狭窄，群体近交程度普遍较高。据报道，美国1990年之后出生的荷斯坦牛平均近交系数为6.0％，娟珊牛为8.2％(VanRaden等，2011)；在加拿大，2000–2007出生的荷斯坦牛平均近交系数为8％，但娟姗牛达到14％(Stachowicz等，2011)。随着近交程度的增加，群体内遗传缺陷基因快速扩散的风险也随之增大。 

2011年，美国农业部家畜遗传改良实验室的科学家VanRaden等首先发现在娟珊牛中存在一种隐性致死遗传缺陷单倍型(JH1)，该单倍型纯合后，导致母牛因胚胎早期死亡而流产，携带该遗传缺陷的种公牛的配种妊娠率降低3.7％(VanRaden等，2011)。之后，Sonstegard等(2013)确定其分子机理为，牛15号染色体的CWC15基因编码区内的C→T突变，导致编码氨基酸从精氨酸突变为终止密码，造成其蛋白产物由原来的231个氨基酸减少到54个氨基酸。因CWC15基因在mRNA剪接中具有重要功能，故该突变最终导致胚胎发育早期死亡。系谱追溯发现，JH1致死单倍型最早可以追溯到1962年出生的美国公牛Observer Chocolate Soldier(Sonstegard等，2013)。该公牛家系在美国的娟珊牛群体中具有重要影响，据统计，过去30多年里，美国娟珊 牛JH1携带率始终高达20～25％(Sonstegard等，2013)。随着遗传物质在世界范围内的交流，该遗传缺陷基因很可能已扩散到世界各国娟珊牛群中。因此，亟需建立对该遗传缺陷基因的分子检测技术，从而对当前的娟珊牛群进行全面筛查，为今后实施科学的繁育管理提供技术手段。 

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测牛CWC15基因隐性致死突变的特异性引物及试剂盒。 

为了实现本发明目的，本发明首先提供用于检测牛CWC15基因隐性致死突变的特异性引物，包括：上游引物CWC15F15’-GGGACTGAGGATGAAGTTGC-3’和下游引物CWC15R15’-GGTTGGGAATACGGAAAGGT-3’。 

本发明还提供含有上述引物的用于检测牛CWC15基因隐性致死突变的试剂盒。 

优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、内切酶TaqαⅠ、酶切缓冲液中的一种或多种。 

更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。 

本发明进一步提供所述引物或试剂盒在检测牛CWC15基因隐性致死突变中的应用，包括以下步骤： 

1)提取待测牛的基因组DNA； 

2)以待测牛的基因组DNA为模板，利用所述引物CWC15F1和CWC15R1，进行PCR扩增； 

3)采用RFLP法检测PCR扩增产物。 

利用上述引物可扩增出包含隐性致死突变位点的CWC15基因片段，长度为1246bp。该片段的野生型等位基因包含2个TaqαⅠ酶切位点(图2)，将1246bp的片段切为3个片段，即(129bp、402bp和715bp)；突变型等位基因，由于C→T突变，导致第1个酶切位点消失，从而只 产生2个条带(402bp和844bp)。因此通过观察酶切产物是否存在844bp条带，即可确定隐性有害基因的携带者。牛CWC15基因隐性有害突变携带者部分测序结果如图1所示。 

步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以25μl计为：10×PCR反应缓冲液2.5μL，Taq DNA聚合酶0.75U，Mg²⁺2mM，dNTP200μM，上、下游引物各20pmol，基因组DNA模板20-50ng，用ddH₂O补齐至总体积25μl。 

步骤2)中PCR反应使用的扩增程序为：95℃预变性8min；然后进行35个循环：95℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min。