[发明专利]芯片表面toehold协助下增强的单碱基突变检测

说明书

技术领域

本发明涉及DNA分子检测技术领域，具体涉及用于检测单碱基突变的双链DNA“toehold交换探针”分子，连接有所述分子的芯片，及其应用。

背景技术

单碱基突变是一种普遍存在的基因变异种类，在人类基因组中几乎有1％的等位基因会出现单碱基突变。基因序列中的变异与人类遗传病密切相关，对早期诊断，药物响应测试，疾病预防，和特定遗传疾病的治疗至关重要，因此基因多态性的研究成为遗传病学和预防医学的研究重点。发明一种简单，省时和高灵敏度的基因多样性检测方法非常有价值和必要。

目前为止，实现单碱基突变检测的方法有很多种，其中重要的方法有酶辅助方法以及DNA杂交的方法。酶辅助方法具有很高的灵敏度以及强的特异性，但是操作过程复杂，酶的不稳定性，价格昂贵和严格的实验条件等固有的缺点，限制了其在复杂样品检测中的应用。另外一种方法，DNA杂交具有独一无二的优势，其中无需酶参与反应，有效克服了以上缺点，同时具备高灵敏度以及特异性，很好实现了的单碱基突变检测。

在DNA杂交检测单碱基突变的方法中主要有界面检测方法和溶液检测方法两大类。其中，采用界面检测方法的，主要集中于SNP基因分型的研究，借助于toehold的调控，来实现单碱基突变检测，但是只能检测toehold上的突变，无法实现DNA全序列不同位点和不同突变类型(SNP，插入和缺失)的单碱基突变检测。溶液检测的方法由Zhang[Zhang DY.Nature Chemistry2012,4,208-214]等人提出，设计了新颖的双链DNA“toehold交换探针”，该探针具有对检测条件(PH，温度和浓度)不敏感的优点，能进行不同突变点和突变类型的单碱基突变检测。但同时由于可逆反应的影响，存在着正确的DNA目标链替换效率低下的缺点。

因此，为了克服现有技术中在DNA单碱基突变上检测的困难，本发明人进行了深入研究。本发明采用DNA杂交的方法，整合界面检测和溶液检测的优势，首次将双链DNA“toehold交换探针”分子接枝到芯片表面，利用双偏振干涉技术(DPI)，借助toehold的DNA链替换反应原理实现在芯片表面实时定量研究单碱基突变进程。该发明不仅实现了DNA全序列不同位点的突变检测，而且克服了溶液中正确的DNA目标链替换效率低的缺点，大幅度提高了正确的目标链DNA的替换效率(达到86.1％)同时又能很好的抑制有突变的目标链DNA的替换效率(约14％)，从而大大提高单碱基检测信号。同时，我们设计了一种简单实用的DNA微阵列芯片，借助普通荧光显微镜，在玻璃芯片表面实现了高通量的单碱基突变检测。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供用于检测单碱基突变的基于toehold的芯片。

具体地，本发明涉及以下各项：

1.一种配体修饰的双链DNA“toehold交换探针”分子，其特征在于：所述分子由N端带有配体的固定链和C端与固定链C端互补的互补链退火得到，从而固定链和互补链的互补区形成双链DNA刚性端，所述双链DNA刚性端靠近配体侧具有自发解离端，互补链的N端非互补部分形成粘性toehold末端。

2.根据1所述的双链DNA“toehold交换探针”分子，其中所述配体选自由生物素，抗体，抗原组成的组。

3.根据1所述的双链DNA“toehold交换探针”分子，其中所述双链DNA刚性端为10-50个碱基对，优选20个碱基对。

4.根据1所述的双链DNA“toehold交换探针”分子，所述自发解离端为2-20个碱基对，优选5个碱基对。

5.根据1所述的双链DNA“toehold交换探针”分子，所述粘性toehold末端为2-20个碱基，优选6个碱基。

6.一种DNA芯片，其特征在于：所述芯片由1-5任一项所述的双链DNA“toehold交换探针”分子通过芯片表面的受体接枝于芯片表面形成。

7.根据6所述的DNA芯片，其中，所述受体选自由NeutrAvidin蛋白，抗原，抗体组成的组，所述芯片为微阵列芯片，其可以包含任意数量的反应池。

8.1-5任一项所述的双链DNA“toehold交换探针”分子和/或权利要求6-7任一项所述的芯片用于检测单碱基突变的用途。

9.一种检测单碱基突变的方法，其中包括以下步骤：

1)将不同种类待检测目标链DNA，与如1-5任一项所述的或如6或7中所述的芯片上接枝的双链DNA“toehold交换探针”分子发生链替换反应；