[发明专利]一株耐苦参碱根瘤菌株及其应用和以其制备的抗污染根瘤菌剂

说明书

技术领域

本发明涉及农业菌剂领域，具体涉及一株耐苦参碱根瘤菌株及其应用和以其制备的抗污染根瘤菌剂。

背景技术

根瘤菌与豆科植物间的共生固氮对农业生产至关重要，农业上常通过为豆科植物接种优良根瘤菌来促进作物生长和增加种子产量，这也是环境友好型农业发展的主要趋势，并具有重大经济意义。据统计，植物施用菌肥后，产量可增幅10-30%不等，对新垦或低产田的增产效果更高达71.2-241%。根瘤菌剂的施用可有效避免因氮肥施用过多而导致的硝酸盐淋溶作用，并有效避免化学氮肥生产过程中的高能量消耗，在植物养分供给及环境保护中的作用不可小觑。

然而，商用根瘤菌剂在实际施用过程中常面临着贮藏期短、污染率高、有效活菌数低以及施用后竞争结瘤效果不理想等诸多现实问题。贮藏时间是衡量菌剂质量的主要指标之一，而污染率则是菌剂贮藏期限的主要影响因素之一。Olsen等对北美根瘤菌剂市场的调查发现，超过25%的产品中含有病原菌或其它抑制根瘤菌生长的微生物，而在阿根廷，Gomes等 (1997) 在对根瘤菌剂的调查中也得到了同样的结论，为获得更好的根瘤菌接种效果，抗污染菌剂的制备势在必行。

即使是贮藏效果良好的根瘤菌剂，在施用到实际的田间环境中后，也并不一定可以成功的与豆科作物共生结瘤。新施用的优良根瘤菌不仅需要面对来自土壤的各种环境条件胁迫，如高土壤含氮量、土壤理化性状的限制以及气候因素等，还需与固氮效率低下、与当地自然环境适应良好的土著根瘤菌进行结瘤竞争。此外，很多土壤微生物与根瘤菌间呈拮抗关系，这其中包括掠食性的无脊椎原生动物类、粘细菌、弧菌和噬菌体，以及其它一些可以产生次生代谢物质或通过改变环境因素而对根瘤菌起抑制作用的微生物。所有这些不利因素都将影响根瘤菌与宿主植株的共生结瘤效果。因此，菌种间的竞争相当重要，这就要求目标菌株具有相对持久的竞争能力。为获得出色的结瘤效果，所接种根瘤菌必须在高效固氮的同时，竞争结瘤能力超过土著根瘤菌及其它阻碍性的微生物，形成更多根瘤。

Jung和Sessitsch等研究发现通过向微生物菌剂中添加抑菌剂类物质可以减少菌剂污染率并增加目标菌株的竞争效果。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，通过筛选耐植物源抑菌剂—苦参碱的高效固氮根瘤菌株，提供了含有一定浓度苦参碱抑菌剂的高竞争型抗污染根瘤菌剂，可有效解决根瘤菌剂在贮藏期间的高污染率以及施用后的低占瘤率问题，同时，还可有效降低根瘤菌剂的贮藏及运输成本。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一株耐苦参碱根瘤菌株，所述耐苦参碱根瘤菌株为草木犀剑菌(Ensfer meliloti)LH3436，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9296，保藏日为2014年6月12日。

耐苦参碱根瘤菌株的筛选方法为：

将紫花苜蓿根瘤中分离的高效固氮根瘤菌点接于含有600mg/L浓度苦参碱抑菌剂的平板中，观察其生长情况，并结合含苦参碱平板培养基对空气和土壤源杂菌的抑制效果，筛选对苦参碱具有较好抗性的耐药菌株，进行传代试验后，选择耐药特性稳定的菌株用作生产菌株。

本发明的第二个目的是提供了上述的一株耐苦参碱根瘤菌株在降低根瘤菌剂污染率及提高占瘤率中的应用。

进一步的，上述的应用，是将耐苦参碱根瘤菌株发酵培养后的菌液，与苦参碱抑菌液混合制备得到抗污染根瘤菌剂。

本发明的第三个目的是提供了一种抗污染根瘤菌剂，是将上述的耐苦参碱根瘤菌株发酵培养后的菌液与苦参碱抑菌液混合制备得到的。

本发明的第四个目的是提供了一种抗污染根瘤菌剂，是将上述的耐苦参碱根瘤菌株发酵培养后的菌液加入至苦参碱抑菌液后，再与过筛灭菌基质混合后制备得到的。

进一步的，上述的一种抗污染根瘤菌剂，所述抗污染根瘤菌剂中，苦参碱抑菌剂的终浓度为600mg/L。苦参碱购自宝鸡方晟生物开发有限公司。

进一步的，上述的一种抗污染根瘤菌剂，是将上述的耐苦参碱根瘤菌株，培养至对数期，即OD_600nm为 0.5-0.8时的根瘤菌液0.2 mL接入至通用YMA液体培养基中，并于28℃下120r/min发酵培养，待活菌数达到10¹⁰cfu/ml时，再加入经0.22μm滤膜过滤灭菌后的苦参碱抑菌剂，搅拌均匀并使苦参碱抑菌剂的终浓度达到600mg/L。