[发明专利]一种用于制备沙门氏菌交叉型抗体的免疫原的合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于制备沙门氏菌交叉型抗体的免疫原的合成方法，属于免疫分析技术领域。

背景技术

沙门氏菌（Salmonella）是一种全球性的食源性致病菌。生物学上沙门氏菌是一类两端钝圆的革兰氏阴性菌，无芽孢，一般无荚膜，主要抗原有O抗原、H抗原、Vi抗原。动物性食品如禽肉、蛋类、乳品容易污染沙门氏菌。人体摄入含菌食物后会引起急性肠胃炎，伤寒，免疫力低下的儿童等人群中甚至出现败血症等症状。

沙门氏菌有2000多种血清型，临床中常见的血清型主要是肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌等。良好规范的生产操作过程和危害分析与关键点控制（HACCP）等管理体系的应用可以很大程度上减少食源性致病菌的发生。同时，对原料和生产过程、产品的质量监测也是保障食品生物安全的重要手段。

目前检测沙门氏菌的方法主要有培养法、免疫学检测方法、分子检测方法。传统的生化培养法是检测沙门氏菌的国标方法，尽管权威可靠，但一般需要5-10天得到结果，且操作过程繁琐，不能适应快速检测的要求；分子检测方法是基于沙门氏菌脱氧核糖核酸（DNA）聚合酶链式反应（PCR）建立起来的。目前发展为传统PCR、实时荧光定量PCR（RT-PCR）、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。与传统PCR相比，RT-PCR具有实现定量检测目标DNA、特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。LAMP方法具有简单、快速、特异性强的特点。LAMP技术在灵敏度、特异性和检测范围等方面不亚于常规PCR技术，不依赖专门的仪器设备，可以现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR。然而，有文献报道LAMP方法在检测牛乳中的沙门氏菌时，会出现假阴性的问题。这可能是与引物受到样品基质影响所引起的。同样常规PCR和实时PCR也面临着检测成本高、对操作人员技术要求较高的问题。

免疫学检测方法主要有酶联免疫反应（ELISA）、免疫层析试纸条（Immuno chromatographic test strip）。ELISA凭借其灵敏、快速、特异性好、易于推广的特点成为食源性致病菌的常规检测方法。抗体的亲和力、交叉反应、稳定性对于ELISA方法的灵敏度和特异性有着关键性的决定作用。虽然胶体金试纸条具有操作简单、稳定性高、不需要借助专门仪器、适合现场快速检测的优点，但一般而言，ELISA比胶体金试纸条具有更好的灵敏度，而且更适合高通量检测，因此ELISA也具有相当广泛的应用空间。

由于沙门氏菌有2000多种血清型，一般沙门氏菌的抗体由于免疫原的限制，特异性较强，因此建立的ELISA方法很难检测到所有的沙门氏菌。本发明首次采用突变型的LPS与载体蛋白KLH进行化学偶联合成人工抗原，制备了可以与突变型LPS以及不同血清型沙门氏菌反应的血清，证明该免疫原合成方法可以用来制备沙门氏菌交叉型抗体。

发明内容

本发明的目的在于建立一种制备沙门氏菌交叉型抗体的免疫原合成方法，为实现沙门氏菌属快速检测提供了方法和思路。

本发明的技术方案，为实现上述目的，本发明首次选用突变型沙门氏菌LPS作为抗原，并用EDC/NHS方法合成了突变型沙门氏菌LPS与载体蛋白的人工抗原。

第一步，抗原选择为突变型鼠伤寒沙门氏菌脂多糖（Ra-LPS），突变型沙门氏菌脂多糖（Ra-LPS）作为抗原可以避免完整型LPS的O特异性侧链引起的免疫反应，制备的血清交叉反应更强。

沙门氏菌主要抗原有O抗原、H抗原。O抗原由O特异性侧链、核心多糖、类脂A组成。不同血清型的沙门氏菌O特异性侧链不同，而核心多糖具有一定的保守性，而且也暴露在菌体外，具有开发群选型抗体的基础。一般完整型的脂多糖O特异性侧链较长，合成免疫原免疫小鼠得到的血清特异性较强，对不同血清型的O抗原交叉较差。本发明选择突变型的鼠伤寒沙门氏菌脂多糖（Ra-LPS，购买于Sigma）作为抗原，可以避免O特异性侧链引起的免疫反应，制备的血清交叉反应更强。

第二步，突变型和完整型LPS核心多糖的结构类似，末端带有3个COOH，而LPS其它部分只带有糖类的OH和H键。利用这一点，采用EDC/NHS方法将突变型LPS的COOH与载体蛋白的NH₂偶联。这样偶联特点在于人工抗原增加了脂多糖的免疫原性，同时暴露了沙门氏菌的共同结构——核心多糖。