[发明专利]一种具有抗肿瘤和凝集活性的猴头菌糖蛋白及其制备方法

说明书

技术领域  本发明属于活性蛋白制备技术领域，涉及一种具有抗肿瘤活性和凝集活性的猴头菌糖蛋白及其制备方法。

背景技术

食药用真菌具有抗肿瘤、降血脂、调节机体免疫、保护心脑血管等多种药用价值，关于其有效成分的分离、纯化及结构测定是目前研究热点之一。已经从其中分离出的活性成分包括：多糖、糖蛋白、萜类化合物和酚类化合物等。近年来，随着对食用真菌多糖复合物分离研究的深入，人们发现其具有显著的抗肿瘤作用。例如：PCP-3A，是一种从金顶侧耳的干子实体中提取分离出的糖蛋白，在浓度为50 μg/mL，作用于U937白血病细胞72 h后，对其抑制率达到97.70 ± 2.31%；HM-3A，是一种从真姬菇鲜子实体中提取分离出的糖蛋白，其多糖和蛋白含量分别为21.7 ± 1.9%和70.2 ± 1.6%，在浓度为100 μg/mL，作用于U937白血病细胞72 h后，对其抑制率达到96.2%。

猴头菌是一种珍贵的食药用真菌，肉质鲜美，营养丰富，有“山珍”之称，与熊掌、燕窝和鱼翅并列为四大名菜。它隶属于担子菌纲多孔菌目齿菌科，具有抗肿瘤、抗肥胖、抗氧化和抗菌等活性，能够有效治疗胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡等疾病。目前关于猴头菌活性成分的研究主要集中在多糖上，例如专利（CN 101921343A）公开了一种利用鲜猴头菇子实体提取多糖的方法，专利（CN 101560262）公开了一种从猴头菌丝体中提取胞内多糖的工艺组合及方法。而关于猴头菌糖蛋白成分的研究很少，仅有专利（CN 1772287）公开了一种猴头菌丝体发酵浸膏糖蛋白在制药中的应用。为了进一步促进关于猴头菌糖蛋白成分的研究，本发明以猴头菌深层发酵菌丝体或固体栽培的子实体为原料，分离纯化得到一种高纯度的具有抗肿瘤活性和凝集活性的猴头菌糖蛋白，并结合红外、气相色谱、氨基酸分析仪等确定了其理化性质。成果为猴头菌糖蛋白的分离纯化提供了参考价值，所提取到的猴头糖蛋白可用于制备可能的抗癌药物或开发成保健品。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤活性和凝集活性的猴头菌糖蛋白及其制备方法。该方法是以猴头深层发酵制备的菌丝体或固体栽培技术获得的子实体为原料，从中分离纯化出具有凝集活性和抗肿瘤活性的猴头菌糖蛋白，获得其基本的理化性质，所用方法简便安全。这种糖蛋白可用于开发成保健品或制备可能的抗癌药物。

为实现本发明的上述目的：

1、一种具有抗肿瘤和凝集活性的猴头菌糖蛋白，该糖蛋白中多糖含量为2~9%，由D-葡萄糖，L-鼠李糖，D-半乳糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、D-木糖和D-果糖等多种单糖组成；蛋白质含量为80~90%，由天冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸等17种氨基酸组；其分子量范围为10~80 KDa。

2、上述糖蛋白具有显著的抗肿瘤作用，比如对人胃癌细胞SGC-7901的生长具有显著的抑制作用，因此，该糖蛋白具有成为抗肿瘤药物的可能性，具有极大的应用和推广前景。

3、上述糖蛋白对小鼠血红细胞具有显著的凝集作用。

4、一种制备上述具有抗肿瘤活性以及凝集活性的猴头糖蛋白的方法：按照下述步骤进行： （1）猴头菌子实体制备：将菌种保藏中心保藏的猴头菌种，如中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏菌株猴头菌ACCC 50011栽培在豆秸粉、玉米秆粉、麦麸、阔叶树木糠、甜菜渣、甘蔗渣或棉籽壳等基质上，20~30 ^oC培养15~30 d，采集得到的子实体。

（2）猴头菌深层发酵菌丝体制备：将菌种保藏中心保藏的猴头菌种如中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏菌株猴头菌ACCC 50011活化，将菌种斜面切割成小块接种到液体种子培养基中25 ^oC条件下培养7 d后收集种子液，接种于发酵罐中25 ^oC，100 r/min进行发酵7天，8000 r/min离心后获得猴头菌丝体。

（3）将上述所得子实体或者菌丝体加入0.8~3倍体积的水后匀浆破碎，4~20 ^oC浸提，离心，弃沉淀，取上清液，上清液浓缩后加入硫酸铵至饱和度为60~90%，静置24~48 h，高速离心取沉淀，加少量水复溶沉淀，将沉淀复溶液置入8000~14000 Da的透析袋，去离子水透析，收集透析液后浓缩，进行DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析，依次用蒸馏水和0.1，0.3，0.5 mol/L NaCl溶液为洗脱液进行阶段式洗脱，收集各阶段洗脱得到的糖蛋白组分，浓缩后冷冻干燥即得到具有抗肿瘤和凝集活性的猴头菌糖蛋白。