[发明专利]桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体，包括骨架载体和正、反义链，其特征在于：以桔小实蝇细胞色素P450基因部分片段为正或反义链，所述细胞色素P450基因部分片段序列如SEQIDNO.1，所述骨架载体为PFGC5941载体。

2.根据权利要求1所述的桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体，其特征在于：所述正义链插入在酶切位点XhoI和NcoI之间，反义链插入在酶切位点XbalI和BamHI之间。

3.根据权利要求2所述的桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体的构建方法，包括如下步骤：

1)细胞色素P450基因目的片段与质粒的连接

提取桔小实蝇总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，以SEQIDNO.2和SEQIDNO.3为引物对细胞色素P450基因的正向目的片段进行PCR扩增，以SEQIDNO.4和SEQIDNO.5为引物对细胞色素P450基因的反向目的片段进行PCR扩增，得到PCR产物，目的片段约为600bp，回收PCR产物，与载体pMD-19连接，转化大肠杆菌DH5α得到重组质粒pMD-19-P1F1和pMD-19-P2F2，进行序列验证，测序正确的目的片段即可用于RNA干扰载体的构建；所述SEQID NO.2～5的序列如下：

SEQIDNO.2：5’-GCCATGGATAGTCTGAACGAACCGAA-3’；

SEQIDNO.3：5’-CCATGGGATAGATTTCGGGATCAC-3’；

SEQIDNO.4：5’-GCTCTAGAGCATAGTCTGAACGAACCGAA-3’；

SEQIDNO.5：5’-CGGGATCCGATAGATTTCGGGATCAC-3’；

2)细胞色素P450基因的RNA干扰载体的构建

将上述测序正确的细胞色素P450基因正向目的片段质粒pMD-19-P1F1与载体PFGC5941分别用XhoI和NcoI双酶切，将pMD-19-P1F1与载体PFGC5941的酶切产物进行连接得到插入正向目的片段的重组质粒PFGC5941-P1F1；将PFGC5941-P1F1和细胞色素P450基因反向目的片段质粒pMD-19-P2F2分别用XbalI和BamHI双酶切，将酶切产物进行连接，即可得到插入正、反义链的RNA干扰载体PFGC5941-P1F1/P2F2，经PCR扩增检测、核苷酸序列分析，目的片段序列正确的干扰载体可用于农杆菌转化。

4.权利要求1-2任一所述的桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体在转基因植物中的应用，所述转基因植物为柑橘属植物。

5.根据权利要求4所述的应用，为将权利要求1-2任一所述的桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体转化有关受体植物，使之对桔小实蝇产生抗性，所述受体植物为柑桔。

6.根据权利要求5所述的应用，所述转化的方法为农杆菌介导法。

7.根据权利要求6所述的应用，所述农杆菌为农杆菌菌株EHA105。