[发明专利]一种快速提取纯化检测毛样蛋白方法

说明书

技术领域

本发明属于化学技术领域，涉及一种快速提取纯化检测毛样蛋白方法。

背景技术

毛发蛋白主要是角蛋白组成，而角蛋白分子间主要是靠二硫键形成稳定的空间网状结构。溶解毛发中的蛋白主要是使二硫键(-S-S)断裂，此外蛋白质分子间高密度的氢键、盐式键等也不能忽视。目前国内现有蛋白质提取技术时间相对较长，程序繁琐，不利于实验室高通量大规模地应用，制备角蛋白主要有一下几种方法：1)机械法，有高压水解法、膨化法、挤压法和挤出法。主要是加热(100～200℃)、加压(0.294～0.98MPa)的方法使角蛋白内部的二硫键断裂水解，从而使其变为可溶、易消化的多肽混合物。2)化学法，有酸碱法、还原法、氧化法和金属盐法。机械法不仅能够让二硫键发生断裂，还能让多肽链发生断裂，得率不高，不利于对蛋白质组成份分析。化学法中的酸碱法提取过程中会产生碱性废水和废酸的蒸汽，污染环境，并对人体有害。近年人们更多地采用还原法制备可溶性角蛋白研究蛋白质。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种快速提取纯化检测毛样蛋白方法。其具体技术方案为：

一种快速提取纯化检测毛样蛋白方法，包括以下步骤：

(1)样品分类，分别剪成小段；

(2)0.15％壬基酚聚氧乙烯(9)醚60℃清洗20min，吸干；

(3)dd水60℃清洗5min，吸干；

(4)二氯甲烷和乙醇洗常温清洗20min，吸干；

(5)超纯水60℃清洗5min，吸干；

(6)0.1M甲醇碱KOH，室温30min，吸干；

(7)超纯水60℃清洗5min，吸干；

(8)磨碎：用水将毛绒浸湿后在液氮中研磨粉碎；

(9)提取：取粉末200mg加入500μL of7M尿素、2M硫脲、50mM Tris和50mM TCEP溶液(pH4)，37℃，振荡消化过夜；.

(10)纯化步骤

1).取0.1ml消化液至2ml离心管，加入0.4ml甲醇，涡旋混匀；

2).再加入0.2ml氯仿，涡旋混匀；

3)再加入0.3ml超纯水，剧烈震荡，10000g离心，1min；

4).小心弃掉上清；

5).加入0.3ml甲醇，涡旋混匀，10000g，离心2min；

6).弃掉上清，倒置室温干燥，备下一步使用；

7).50-100微升1X蛋白上样缓冲液溶解，沸水浴5min，备SDS-PAGE跑胶使用。

进一步优选，步骤(4)中所述二氯甲烷和乙醇洗的体积比为V/V2∶1。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明采用的“壬基酚聚氧乙烯(9)醚”非离子表面活性剂，能够有效的清洗毛样表面污渍，再用二氯甲烷和乙醇祛除内部脂质，再用甲醇碱祛除结合脂肪酸。通过物理粉碎，采用还原法，Tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)还原角蛋白二硫键，再利用利用高浓度尿素和硫脲使其蛋白膨胀溶解，最终得到可溶性蛋白质，该方法反应活性温和易溶、毒性小，而更容易操作和应用后续蛋白质谱分析。

附图说明

图1为SDS-PAGE检测结果，其中：M为预染蛋白marker(14.4-120KD)；1为陕北白绒山羊A的毛样，2、3为陕北白绒山羊A的绒毛羊；4为陕北白绒山羊B的毛样，5、6为陕北白绒山羊B的绒毛羊。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

一种快速提取纯化检测毛样蛋白方法，包括以下步骤：

(1)样品分类，分别剪成小段；

(2)0.15％壬基酚聚氧乙烯(9)醚60℃清洗20min，吸干；

(3)dd水60℃清洗5min，吸干；

(4)二氯甲烷和乙醇洗常温清洗20min，吸干；

(5)超纯水60℃清洗5min，吸干；

(6)0.1M甲醇碱KOH，室温30min，吸干；

(7)超纯水60℃清洗5min，吸干；

(8)磨碎：用水将毛绒浸湿后在液氮中研磨粉碎；

(9)提取：取粉末200mg加入500μL of7M尿素、2M硫脲、50mM Tris和50mM TCEP溶液(pH4)，37℃，振荡消化过夜；.

(10)纯化步骤

1).取0.1ml消化液至2ml离心管，加入0.4ml甲醇，涡旋混匀；

2).再加入0.2ml氯仿，涡旋混匀；