[发明专利]一种具有抗子宫内膜异位症的靶向基因纳米粒及制备

说明书

技术领域

本发明属制药领域，涉及基因纳米粒的制备和基因纳米粒在抗子宫内膜异位症中的应用。

背景技术

子宫内膜异位症（简称内异症）是生育期女性的一种常见病，且发病率呈上升趋势，其生殖年龄女性发病率可高达15%，其临床特点主要表现为疼痛、包块以及不孕。虽然目前有多种方法治疗内异症，但无论经过何种治疗，其5年内的复发率在40％以上，且有1%内异症患者恶变为特殊类型卵巢癌的可能性。该病所具有的良性病本质、恶性生物学行为如侵袭、转移、复发等潜能使之成为难治之症。

目前涉及抗血管形成药物等治疗内异症的研究均在动物模型水平上，主要有血管内皮生成抑制剂TNP-470、内皮抑制素、血管抑制素等几种血管形成抑制剂。虽然这些血管形成抑制剂均有不同程度抑制正常增殖期子宫内膜在模型动物体内的种植和生长，但对已建模的动物体异位症病灶的治疗作用尤其是长期治疗作用如何，有待研究。大量研究证实，水通道蛋白（AQP1）大量表达于不成熟的新生血管内皮细胞，且AQP1的过度表达与血管生成正相关。且目前我们对子宫内膜异位症的研究发现：内异症血管内皮细胞中过表达AQP1。那么，针对血管形成的水通道蛋白因子及其关键步骤进行干预，可以达到预防和治疗内异症的目的。

小分子干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因静默的过程。由于siRNA具有高度特异性，可使目的基因稳定静默而不影响正常基因的表达，因此，使用siRNA干扰技术静默AQP1基因表达，减少或抑制水通道蛋白的表达，把水通道蛋白做为药物靶点，有望成为治疗内异症的新方法。

那么，如何促进靶细胞的摄取和表达呢？在增加细胞摄取能力方面，阳离子聚合物得到了广泛的应用，如聚乙烯亚胺（PEI），其分子存在许多氨基，具有所谓“质子海绵效应”，在入胞后的内吞和溶酶化过程中发挥缓冲作用，破坏并逃逸溶酶体的降解，实现基因高效表达。由于PEI具有较高的细胞毒性和有限的生物降解程度，我们通过降解天然的阳离子多糖壳聚糖获得壳寡糖（chitosan oligosaccharide, CSO），既保留了氨基，又具有较小分子量、较好水溶性和更低的细胞毒性，所以在CSO上适当嫁接PEI，一方面提高转染效率，另一方面降低细胞毒性。此外，为更好地帮助外源性基因转移至特定靶细胞，我们将应用细胞表面特异性受体去识别相应的配体。研究表明，大多数肿瘤细胞和内异细胞有大量的透明质酸(Hyaluronic acid, HA)受体，所以我们将应用HA包裹CSO-PEI/siRNA，以提高细胞靶向性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种具有高效抗子宫内膜异位症的基因纳米粒，该基因纳米粒负载了小分子干扰RNA基因药物，其纳米粒材料由壳寡糖（重均分子量为17.5 KDa，脱乙酰度为95%）、聚乙烯亚胺（分子量为800 Da）和透明质酸（分子量为60 KDa）组成，其中壳寡糖与聚乙烯亚胺的比例为1:1，透明质酸占总纳米粒的比例为5-30%，所使用的基因药物含磷摩尔数与纳米粒含氮摩尔数的比例（即N/P比）为0.1-16。

该载药纳米粒与游离基因药物相比，可显著改善基因药物在细胞水平转染能力和动物水平的抗子宫内膜异位症的效应。

本发明的另一个目的是提供一种具有高效抗子宫内膜异位症基因纳米粒的制备方法，具体通过以下途径实现：

（1）采用高碘酸法PEI修饰CSO。称取CSO 1.2g，高碘酸钠0.06g，分别溶于180mL和60mL PH 4.5的醋酸缓冲溶液中，反应前两溶液均氮气除去溶解氧。然后将高碘酸钠溶液滴加入CSO溶液中，4℃冰浴下，400 rpm搅拌反应48h。反应结束后，加一定量乙二醇终止反应。将终反应液置透析袋中透析8h，除去杂物，透析液待用。另称取适量的PEI溶于水中，缓慢加入到透析液中，搅拌反应48h。反应结束后，加一定量硼氢化钠终止反应，然后透析48h，冻干，收集产物（CSO-PEI共聚物）。

（2）精密称取一定量的CSO-PEI共聚物冻干品，加入适量的去离子水分散，制备得到浓度为1mg/mL 的共聚物溶液；另取一定量0.5mg/mL siRNA溶液，和上述共聚物溶液按一定比例缓慢混合，室温静置30min，得到不同N/P比的CSO-PEI/siRNA复合纳米粒。然后将其复合纳米粒与0.3 mg/mL的透明质酸(Hyaluronic acid，HA)溶液自组装30min，温度为30℃，得(CSO-PEI/siRNA)HA复合纳米粒。