[发明专利]一种重组猪瘟病毒NS3蛋白、ELISA试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种重组猪瘟病毒NS3蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的重组猪瘟病毒NS3蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)根据GenBank登录号为AY775178.2的CSFV全基因序列中的NS3编码区序列设计一对引物N1、N2：

N1：5′-GTGGGTACCGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG-3′

N2：5′-AGCCCCGGGTAGACCAACTACTTGTTTTAG-3′；

(2)用引物N1、N2对CSFV的cDNA进行PCR扩增，得到NS3目的片段；

(3)用Kpn I、Sma I双酶切NS3片段和质粒pET32a-Intein-ELK16，回收、连接，得到pET32a-NS3-Intein-ELK16表达载体；

(4)将所述pET32a-NS3-Intein-ELK16表达载体表达的重组蛋白在诱导切割离心后，收集上清得到重组猪瘟病毒NS3蛋白。

3.如权利要求2所述的重组猪瘟病毒NS3蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述质粒pET32a-Intein-ELK16的制备方法包括以下步骤：

将含有Mycobacterium xenopi gyrA基因的Mxe Gy rA(载体中的Intein)内含肽的大肠杆菌表达载体pTXB1用EcoR I和Sma I双酶切获得Mxe Gy rA内含肽；

合成具有16个氨基酸的短肽ELK16-(LELELKLK)2和PT linker，即PTlinker-ELK16，然后将内含肽末端补平后与PTlinker-ELK16连接起来，再将其克隆到pET32a中，构成pET32a-Intein-ELK16；其中，所述短肽ELK16-(LELELKLK)2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述PT linker的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.如权利要求3所述的重组猪瘟病毒NS3蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述诱导切割离心包括以下步骤：将目的蛋白、含可切割位点的肽段和自聚集短肽的融合蛋白进行融合表达，含有内含肽和自聚集短肽的重组蛋白是以聚集体的形式存在，将表达上述融合蛋白的宿主细胞破碎后，离心后获得沉淀；然后利用诱导缓冲液在诱导切割位点处的诱导切割，诱导切割位点断裂将目的蛋白从聚集体释放到溶液中，通过离心达到纯化的目的。

5.一种ELISA试剂盒，其特征在于，包括ELISA板、碳酸盐缓冲液、PBST缓冲液、含5％脱脂乳的PBST缓冲液、辣根过氧化酶标记的兔抗猪二抗、显色液以及终止液；所述ELISA试剂盒还包括权利要求1所述的重组猪瘟病毒NS3蛋白。

6.如权利要求5所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述显色液为TMB显色液，所述终止液为浓度为2M的H₂SO₄。

7.权利要求5或6所述的ELISA试剂盒在用于鉴别猪瘟病毒和重组腺病毒疫苗方面的应用。

8.如权利要求7所述的ELISA试剂盒在用于鉴别猪瘟病毒和重组腺病毒疫苗方面的应用，其特征在于包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述的重组猪瘟病毒NS3蛋白用碳酸盐缓冲液包被于ELISA板混匀，100μL/孔，于4℃包被过夜后，依次进行洗板、封闭和洗板处理；

(2)加入待检血清，用含5％脱脂乳的PBST稀释，100μL/孔，同时设空白对照，于37℃作用1h后，进行洗板处理；

(3)加入辣根过氧化酶标记的兔抗猪二抗，100μL/孔，于37℃作用50min后，进行洗板处理；

(4)加入TMB显色液，100μL/孔，于室温避光作用30min后，加入终止液，100μL/孔，测定OD₄₅₀nm值。

9.如权利要求8所述的ELISA试剂盒在用于鉴别猪瘟病毒和重组腺病毒疫苗方面的应用，其特征在于，在步骤(1)中，所述洗板为用PBST洗3次，拍干；所述封闭为用含5％脱脂乳的PBS封闭，200μL/孔，于37℃作用1h；

在步骤(2)和(3)中，所述洗板为用PBST洗5次，拍干。

10.如权利要求9所述的ELISA试剂盒在用于鉴别猪瘟病毒和重组腺病毒疫苗方面的应用，其特征在于，在步骤(2)中，所述待测血清包含猪瘟病毒或重组腺病毒；其中，所述猪瘟病毒包括疫苗毒和野毒，所述重组腺病毒仅包括猪瘟病毒E0和E2基因。