[发明专利]一种高效表达与制备外分泌型人源AFP的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外重组高效表达制备具有生物活性AFP的方法，具体涉及利用分泌型毕赤酵母表达系统表达具有生物活性的人源AFP重组蛋白的方法，属于生物医学分析领域。

背景技术

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)ORF全长1830bp，翻译后蛋白含有609个氨基酸残基，分子量约70kDa。AFP是一种肿瘤相关的单链糖蛋白，其糖链部分具有癌胚性变化的特征。AFP为胎儿时期肝脏合成的一种胚胎蛋白，出生后一周消失，以后完全被白蛋白替代。正常人不产生AFP，当患肝细胞癌、卵黄囊和胚胎样肿瘤及部分肝外肿瘤时机体可重新合成AFP，因此临床上AFP被当成一种肝癌及生殖细胞肿瘤的血清标志物来使用。目前，肝癌检查主要包括血清甲胎蛋白(AFP)和肝脏影像学检查。检测AFP是当前诊断肝癌最简便、灵敏、快捷的方法，现认为它在发现早期肝癌方面有独一无二的价值，在临床上被认为是肝癌的经典肿瘤标志物，因而被当作诊断肝癌的金标准。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近几年发展起来的较为完善的、被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统。毕赤酵母表达系统主要有以下优点：1)具有强有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase，AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；2)作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；3)营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产；4)在P.pastoris中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化；5)糖基化程度低，与S.cerevisiae相比，P.pastoris不产生过度的糖基化。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种能够大规模制备具有生物活性且高纯度的AFP的高效表达具有生物活性的AFP重组蛋白及其制备方法。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种高效表达与制备外分泌型人源AFP的方法，该方法主要包括如下三个方面的内容：

(1)利用基因合成技术合成AFP的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物学方法构建酵母重组表达质粒PpICZ α A-AFP，并进行质粒抽提；

(2)使用毕赤酵母表达系统体外诱导表达分泌型AFP重组蛋白，并通过优化表达时间、诱导剂添加量等条件得出最佳诱导条件；

(3)优化硫酸铵分级沉淀,从发酵液上清中分离纯化得到分泌到胞外的AFP重组蛋白，在55％硫酸铵浓度下目的蛋白AFP几乎全部析出，且纯度高达98.844％。

本发明进一步的技术方案是：所述三个方面的内容中，分别包含有如下步骤：

第(1)方面的内容中包括如下两个步骤：

a.利用基因合成技术，合成人源AFP序列；

b.设计带酶切位点的引物，通过PCR得到带有双酶切位点的AFP克隆质粒，并进行质粒提取；

第(2)方面的内容中包括如下两个步骤：

c.将b步骤中获得的质粒通过双酶切克隆到PpICZ α A载体中，构建PpICZ α A-AFP重组表达质粒，并进行质粒抽提；

d.将c步骤中获得的质粒进行线性化后电转进入毕赤酵母GS115中，通过优化感受态细胞GS115浓度，获取高转染率，通过PCR鉴定挑取阳性克隆；

e.将d步骤中挑取的阳性克隆同时用甲醇进行小量诱导表达，通过对甲醇添加量、诱导时间、菌密度等表达条件的优化，获得最佳诱导表达条件并获取最佳表达重组菌；

f.通过步骤e中实验得出，甲醇浓度为0.5％，诱导表达第3天的重组蛋白的分泌量最大；

g.通过前面实验的基础，再将表达体系扩大至2L，收集表达第3天的发酵上清液；

第(3)方面的内容中包括如下两个步骤：

h.将g步骤中获得的发酵液通过硫酸铵分级沉淀纯化蛋白，设计不同硫酸铵浓度梯度获得沉淀蛋白；

i.将h步骤中获得的蛋白回溶后经透析，测其含量和纯度得出目的蛋白在55％硫酸铵浓度下几乎已全部析出，且经HPLC检测其纯度高达98.844％。

本发明将纯化得到的分泌重组蛋白AFP用临床检测电化学发光法检测其生物活性，其值达3500ng/mL。

附图说明

图1是毕赤酵母表达系统的质粒PpICZ α A的质粒图谱，

图2是重组表达质粒pPICZ α A-AFP构建的PCR鉴定图，

图3是酵母GS115重组菌株的菌落PCR鉴定图，