[发明专利]基于核酸适配体的非标记型荧光传感器检测啶虫脒的方法

权利要求书

1.基于核酸适配体的非标记型荧光传感器检测啶虫脒的方法，其特征在于利用金纳米粒子对量子点的荧光猝灭作用检测啶虫脒的残留量，包括以下步骤：CdTe量子点的合成和纯化；金纳米粒子(AuNPs)的制备；通过测定圆二色谱观察核酸适配体与啶虫脒的特异性结合作用；通过TEM和DLS测定观测核酸适配体对金纳米粒子的保护作用；运用金纳米粒子对CdTe量子点的荧光猝灭作用方法检测啶虫脒并进行实际样品的检测。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述CdTe量子点的制备步骤如下：

首先称量0.0256g Te粉和0.0386g NaBH4加入到三口烧瓶中，用高纯水配制pH＝11的NaOH溶液100mL，向其中通入10min N2，装于一恒压滴定漏斗①中，用高纯水配制浓度为4×10-3mol/L的CdCl2溶液100mL，加入67μL TGA，用1mol/L的NaOH溶液调节pH＝11，向其中通入10min N2，将得到的澄清透明溶液装于另一恒压滴定漏斗②中，将整个装置与真空、N2系统连接起来，经历几次抽真空和通N2的步骤除去体系中的O2；略微加热，打开漏斗①，加入3～5滴水，电磁搅拌，引发反应，待Te粉基本反应完全后(溶液为红色并且黑色粉末消失)，将①中的水全部加入，得到透明浅红色溶液，再将②中溶液全部加入，整个过程都进行N2保护；溶液全部加入后继续搅拌10min，撤去N2保护，将得到的混合溶液用50％的微波功率输出加热进行晶体生长反应；得到的产物加入等体积的异丙醇洗涤，并离心除去过量前体，最后将其再分散在200mL的纯净水中。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述金纳米粒子(AuNPs)的制备步骤如下：所有的玻璃器皿都经过王水浸泡，双蒸水清洗，晾干备用，配制试剂所用蒸馏水需通过0.45μm的滤膜过滤；制备时，向洁净的三口烧瓶中加入1mmol/L的氯金酸50mL，在搅拌的情况下使其沸腾，紧接着快速加入38.8mmol/L的柠檬酸三钠5mL，边加热边搅拌，溶液由淡黄色变成酒红色，反应持续10分钟，停止加热，溶液冷却至室温后，用0.45μm的微孔膜过滤，4℃保藏，所制得的金纳米粒子粒径为13nm。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述通过测定圆二色谱观察核酸适配体与啶虫脒的特异性结合作用的步骤如下：

在两个装有10mM NaCl和5mM MgCl₂的10mM Tris缓冲液的离心管(1.5mL)中加入0.25μM啶虫脒的核酸适配体，再在其中一个离心管中加入0.5μM的啶虫脒，另一个离心管不加，测圆二色谱图。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述通过TEM和DLS测定观测核酸适配体对金纳米粒子的保护作用的步骤如下：

①样品制备

取四个2.0mL的离心管，编号为a,b,c,d，分别依次加入，a管(3×10^-9mol·L^-1金纳米粒子)，b管(3×10^-9mol·L^-1金纳米粒子，55mM NaCl)，c管(3×10^-9mol·L^-1金纳米粒子，55mM NaCl，0.25μM核酸适配体)，d管(3×10^-9mol·L^-1金纳米粒子，55mM NaCl，0.25μM核酸适配体，0.5μM啶虫脒)；

②参数

将四种样品分别滴于四个铜网上，室温晾干，用JEM-2100F透射电镜于200kV的加速电压下扫描样品①的透射电镜；

用Nano ZS纳米粒度仪测定样品①的粒径分布。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸适配体的非标记型荧光传感器检测啶虫脒的步骤如下：

56μL不同浓度的啶虫脒加入62μL1.6μM的核酸适配体，涡旋混合10min后加入266μL金纳米粒子(4.8×10^-9mol·L^-1)，继续涡旋混合8min后加入44μL500mM的NaCl，再次涡旋混合10min.最后加入100μL1.4×10^-6mol·L^-1的CdTe QDs，用荧光分光光度计进行检测。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述实际样品的检测是取白菜进行的：

取10g白菜，将其切碎，并和50mL的甲醇混合并超声搅拌60分钟，取上清液，并通过滤纸过滤，提取和过滤重复两次，过滤液用10mL的甲醇漂洗，其混合液再在真空旋转蒸发器里被浓缩，溶液的体积被浓缩到0.5mL之后达到干燥状态，残渣在娃哈哈纯净水中溶解，定容到5mL，在样品提取液中，如权利6所述，加入不同浓度的啶虫脒标准品，根据[(F-F₀)/F₀]与啶虫脒的浓度建立标准曲线，啶虫脒的检出限为0.192μg/kg，线性范围为1.2μg/kg-21.6μg/kg。